Počítání buněk pomocí hemocytometru
Obrázek 1. Hemocytometer gridlines.
schéma Hemocytometru označující jednu ze sad 16 čtverců, které by měly být použity pro počítání.
Webináře přepis
Počítání buněk umožňuje přesné stanovení počtu buněk, a proto soulad mezi experimenty. Toto video nastíní postup pro počítání buněk suspenze i adherence pomocí hemocytometru.
před zahájením práce důkladně nastříkejte vnitřek bezpečnostní skříně laminárního toku dezinfekčním prostředkem a otřete jej tkání., Použitou tkáň zlikvidujte v příslušném odpadním koši. Dále nastříkejte vnitřek kapuce 70% ethanolem a otřete jej tkání. Kapota je nyní čistá a připravená k použití. Odstraňte buněčné kultivační médium a trypsin z ledničky a vložte do zvlhčeného inkubátoru oxidu uhličitého 37 stupňů C, aby se zahřál. Mezitím se podívejte na buňky, které mají být počítány pomocí mikroskopu, abyste zkontrolovali jakékoli vizuální známky bakteriální a houbové kontaminace. Stříkací lahve a pipety se 70% ethanolem před hraním v bezpečnostní skříni laminárního toku.,
u suspenzních buněk jemně míchejte baňku, aby se zajistilo, že buňky budou dobře promíchány. Než se dostanou šanci usadit, vezměte vzorek 0,5 mililitru buněčné suspenze a pipetujte do sterilní trubice eppendorf. Pro adherenční buňky odstraňte stávající média, omyjte PBS při pokojové teplotě a přidejte trypsin EDTA k oddělení buněk. Viz tabulka jedna pro požadované objemy PBS a trypsinu. Inkubujte buňky po dobu dvou až pěti minut ve zvlhčeném 37 stupních C, inkubátoru oxidu uhličitého. Inkubační doba bude muset být optimalizována pro typ buňky., Když jsou všechny buňky odděleny, neutralizujte trypsin EDTA teplým sérem obsahujícím růstová média vhodná pro buňky a kulturu. Požadované objemy naleznete v tabulce jedna.
buňky znovu suspendujte jemným pipetováním buněčné suspenze nahoru a dolů třikrát a přeneste je do 50 mililitrové zkumavky. Odstředěte buněčnou suspenzi po dobu pěti minut při 1 000 otáčkách za minutu při pokojové teplotě., Odstraňte supernatant pomocí sterilní sérologickou pipetování a resuspendujte buňky, paleta s 37 stupňů C sérum obsahující růstové médium na původní objem výchozí kultury. Pomocí pěti mililitr sterilní pipetovat, vzít a 0,5 ml vzorku buněčné suspenze, a přenést do sterilní mikrozkumavky.
k počítání připravte jednorázový hemocytometr. Pomocí pipety P2000 Gilson vezměte 100 mikrolitrů suspenze a přidejte do 400 mikrolitrů trypan blue, poznámka,.08% a dobře promíchejte., Vezměte 100 mikrolitrů z trypanovou modř buněčné suspenze se promíchá, a pečlivě napipetuje kapka suspenze do studny počítání komoře, což umožňuje vzlínání čerpat vzorku. Dávejte pozor, abyste nepřeplnili počítací komoru. Zobrazte oblast počítání pod 10násobným zvětšením pomocí obráceného mikroskopu. Pomocí mikroskopu se zaměřte na jednu ze čtyř mřížek na hemocytometru a počítejte buňky negativně na trypanovou modrou. Tyhle jsou životaschopné. Také si všimněte, kolik buněk bylo pozitivní na trypan blue., Tyto buňky jsou mrtvé a toto číslo lze později použít k výpočtu procentní životaschopnosti kultury, pokud je to nutné.
při počítání použijte systém, ve kterém se buňky počítají pouze tehdy, když jsou uvnitř čtverce nebo na pravé nebo spodní hranici. Zaznamenejte počet buněk počítaných v této sadě 16 čtverců a přesuňte hemocytometr, dokud nebudou započítány všechny čtyři sady 16 čtverců na hemocytometru a jejich hodnoty zaznamenány., Pro výpočet koncentrace buněk vezměte průměrný počet životaschopných buněk ve čtyřech sadách 16 čtverců a vynásobte 10 000, abyste získali počet buněk na mililitr. Pak to vynásobte pěti, abyste opravili jedno z pěti ředění z modrého přídavku trypan. Tato konečná hodnota je počet životaschopných buněk na mililitr v původní buněčné suspenzi.,
například, pokud vaše životaschopných buněk je 200 000 buněk na mililitr v objemu 20 mililitrů a chcete vidět 10 000 buněk do nové baňky, pak se budete muset přenášet 50 µl z vaší buněčné suspenze do nové baňky. Přeneste požadovaný objem buněčné suspenze do nové baňky. Doplňte média a vložte do inkubátoru.