z metody identifikace koaguláza-negativních stafylokoků
BIOCHEMIE CHARAKTERISTIKA
Porovnání metody identifikace koaguláza-negativních stafylokoků
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Jurij K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil
ABSTRAKT
Koaguláza-negativní stafylokoky (CNS) identifikace druhů je stále obtížné pro většinu klinických laboratořích., Schéma navržené Kloos a Schleifer a modifikován Bannerman je referenční metoda použitá pro zjišťování stafylokokových druhů a poddruhů; nicméně, tato metoda je poměrně pracná pro běžné použití, protože to vyžaduje využití velkého počtu biochemických testů. Cílem této studie bylo porovnat čtyři metody, tj. referenční metoda, API Staph systém (bioMérieux) a dvě metody upraven od referenční metodou v naší laboratoři (zjednodušená metoda a disková metoda), v identifikaci 100 CNS kmenů., Ve srovnání s referenční metodou zjednodušená metoda a metoda disku správně identifikovaly 100 a 99% druhů CNS, zatímco tato rychlost byla 84% pro systém API Staph. Nepřesné identifikace API Staph metoda byla pozorována u Staphylococcus epidermidis (2.2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37.5%) a S. warneri (47.1%)., Zjednodušená metoda pomocí jednoduché identifikační systém navrhovaný v této studii bylo zjištěno, že být efektivní u všech testovaných kmenů, 100% citlivost a specifičnost a dokázal být k dispozici alternativní pro identifikaci stafylokoků, nabízí vyšší spolehlivost a nižší náklady než v současnosti dostupné komerční systémy. Tato metoda by byla velmi užitečná v klinické mikrobiologické laboratoři, zejména v místech s omezenými zdroji.,
Klíčová slova: koaguláza-negativní stafylokoky – metody – identifikace – API Staph
Čtyřicet druhů rodu Staphylococcus byly identifikovány tak daleko (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, koaguláza-pozitivní druh, který produkuje řadu enzymů a toxinů, je nejlepší známý a byl často zapleten v etiologii řady infekcí a intoxikací zvířat a člověka, vzhledem k tomu, koaguláza-negativní stafylokoky (CNS), což většina druhů, které byly považovány za saprofytické nebo jen zřídka patogenní (Kloos & Schleifer 1975)., Za posledních deset let, nicméně, CNS byly uznány jako etiologické agens řady infekčních procesů, což představuje mikroorganismy nejčastěji izolovány z krevních kultur (Huebner & Goldmann 1999).
Zhruba polovina z CNS druhů přirozeně kolonizují člověka, a v současné době jsou považovány za v podstatě oportunistický etiologické agens, které převládají v mnoha organických situacích vyvolat závažné infekce (Bannerman 2003)., Vznik CNS jako patogeny různých infekcí, může být výsledkem rostoucí využívání invazivní postupy, jako je intravaskulární katetry a protézy u pacientů, kteří podstupují intenzivní léčbu pacientů s oslabenou imunitou, předčasně narozené děti, pacienti s neoplasias, a u pacientů po transplantaci (Kloos & Bannerman 1994).
druhy, které nejčastěji způsobují onemocnění u lidí, jsou s., epidermidis (bakteriémie, infekce v důsledku implantované lékařské zařízení, jako jsou protézy a katétry, infekce chirurgických ran, peritonitidy u pacientů na kontinuální peritoneální dialýze, osteomyelitida, endoftalmitida atd.), S. haemolyticus (endokarditida, peritonitida, sepse a infekce močových cest, ran, kostí a kloubů), a. S. saprophyticus (infekce močových cest a septicemic procesy). Další významný oportunní patogeny jsou S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus, a. S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis se zdá být spojen s endokarditidou po implantaci protetických chlopní, s peritonitidou, s infekcí měkkých tkání a s vertebrální osteomyelitidou (Osmon et al. 2000).
s ohledem na známý patogenní potenciál CNS v nemocničním prostředí, zájem o různé druhy vztahující se k infekci a jejich toxigenic potenciál a virulence se zvýšil za posledních deset let a vedla k vyhlášení různých studií na tyto aspekty., Navzdory rostoucí charakterizaci infekcí CNS však tyto mikroorganismy nejsou identifikovány v klinických mikrobiologických laboratořích. Schéma navržené Kloos a Schleifer (1975) a upravena Bannerman (2003) je metoda běžně používá; nicméně, tato metoda je poměrně pracná pro běžné použití, protože velký počet biochemických testů, které jsou požadovány., Ve většině laboratoří je běžné, stafylokoky jsou identifikovány na základě morfologických aspektů kolonií, gram barvení a kataláza a koaguláza výroby, která pouze umožňují klasifikaci stafylokoků do S. aureus a non-izolátů S. aureus, s ní prostě být klasifikovány jako CNS.
vývoj metod pro stanovení stafylokokových druhů a poddruhů umožňuje lékaři získat informace o různých CNS přítomných v klinických vzorcích a považovat je za etiologické agens infekční procesy., Přesná identifikace CNS je zapotřebí mít časné predikce potenciálu patogenity nebo antibiotické citlivosti každého klinického izolátu a objasnit klinický význam jednotlivých druhů. Opakované izoláty CNS od pacientů s invazivními onemocněními by měly být identifikovány, aby bylo možné porovnat kmeny. Na druhé straně je identifikace druhů předpokladem před provedením postupů psaní epidemiologických studií.,
v posledních letech bylo vyvinuto několik komerčních systémů pro rychlou identifikaci stafylokoků jako alternativa ke klasickým identifikačním protokolům (Bannerman 2003). Tyto diagnostické systémy však představují problémy, jako jsou náklady a inkubační doba, často poskytují nespolehlivé výsledky (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Mnoho z těchto souprav bylo navíc navrženo pro identifikaci všech známých druhů CNS (tj. klinických, veterinárních a alimentárních izolátů), a proto nejsou příliš specifické., Na základě výše uvedených úvah a s ohledem na potřebu rychlé, jednoduché a spolehlivé metody, cílem této studie bylo porovnat čtyři techniky pro identifikaci CNS, tj. referenční metoda (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), komerční API Staph systém, a dvě metody upraven od referenční metodou v naší laboratoři k vývoji alternativních metod identifikace kombinuje jednoduchost, spolehlivost a nízké náklady, zejména na místech s omezenými zdroji.,
MATERIÁLY A METODY,
Izoláty – sto CNS izoláty získané z klinických vzorků pacientů hospitalizovaných ve fakultní Nemocnici Fakulty, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu Areálu, byly studovány. Kmeny byly izolovány, jak je popsáno Koneman et al. (1997).
Identifikace CNS – izoláty získané z klinických vzorků byly naočkuje na krevní agar a gram obarví, aby byla zaručena jejich čistota a zachování jejich morfologie a specifické barvení., Po potvrzení těchto charakteristik izolátů byly předloženy kataláza a koaguláza testy. Staphylococcus byl diferencované z Micrococcus druhů na základě oxidace a fermentace glukózy, rezistence k bacitracinu (0.04 U) indikována absence inhibice halo nebo přítomnost inhibice halo měření až 9 mm v průměru, a náchylnost k furazolidon (100 µg) charakterizován inhibiční zóny měření 15 až 35 mm v průměru (Baker, 1984).
pro identifikaci CNS byly použity čtyři níže popsané metody., Následující mezinárodní referenční CNS kmeny byly použity jako ovládací prvky: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), a. S. saprophyticus (ATCC 15305).,
Referenční metoda navržená Kloos a Schleifer (1975) a Vazal (2003) – Tato metoda se skládá ze sady biochemických testů, které určují využití cukrů, xylózy, arabinóza, sacharosa, trehalosa, maltóza, mannitol, laktosa, xylitol, ribóza, fruktóza, manóza, výroba hemolyzinový, redukci obsahu dusičnanů, přítomnost ureázy a ornitin dekarboxylázu, a odolnost vůči novobiocin vyznačuje inhibice halo až 16 mm. Hodnoty testů byly získány po 24, 48 a 72 h inkubace při 37 ° C ve vzduchu inkubátoru.,
API Staph-systém API Staph (bioMérieux) je zkušební baterie připravená k použití sestávající z 20 biochemických testů, ke kterým je přidána homogenní bakteriální suspenze při zákalu 0, 5 McFarland. Po 24 h inkubace při 37 ° C a doplnění VP (VN1 a VP2), NIT (NIT1 a NIT2) a PAL (ZYM a ZYM B) činidla doprovázející kit, reakce byly interpretovány a mikroorganismy byly identifikovány pomocí analytické katalog., Identifikace je založena na číselném systému sestávajícím ze sedmi číslic, který poskytuje procentuální identifikaci (%ID), přičemž hodnota > 80% je přijatelná.
modifikované metody-byly použity dvě metody identifikace modifikované v naší laboratoři (zjednodušená metoda a metoda disku). Zjednodušená metoda byla rozdělena do dvou kroků. Během první krok, kvašení xylózy, sacharosa, trehalosa, maltóza, mannitol, výroba hemolyzinový, a anaerobní růst v thioglykolát byly testovány (Tabulka I)., Testy použité ve druhém kroku se lišily podle výsledků získaných v prvním identifikačním kroku po inkubaci 72-h při 37 ° C. Doplňkové testy používané v průběhu druhého kroku (v případě potřeby), jsou uvedeny v Tabulce II.
disk metoda se skládala z následujících testů: fermentace arabinóza, sacharosa, trehalosa, maltóza, mannitol a laktózy, snížení dusičnanů, výroba hemolyzinový, testy pro ureasu a ornitin dekarboxylázu, a odolnost vůči novobiocin., Pro test fermentace cukru byly komerčně dostupné disky specifické pro každý cukr umístěny do zkumavek obsahujících 2, 5 ml purpurového živného média. Bakteriální suspenze byly naočkovány, jak je popsáno Kloos a Schleifer (1975). Hodnoty pro tyto dvě metody byly získány po 24, 48 a 72 h inkubace při 37 ° C a druhy CNS byly identifikovány podle identifikačního schématu navrženého na obrázku.,
Statistické analýzy – Pro určení míry shody mezi metody používané pro identifikaci CNS (zjednodušenou metodu, metodu disku a API Staph) a referenční metodu (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), citlivost a specifičnost testů (Sox 1986) byly hodnoceny následovně.,
Citlivost: podíl CNS kmenů, které byly pozitivní na určité druhy, podle referenční metody, a které byly identifikovány jako stejného druhu metodou analyzovány (zjednodušená metoda, disku nebo API Staph).
Specifičnost: podíl CNS kmenů, které jsou negativní na určité druhy, podle referenční metody a které byly také negativní stejného druhu při testování metodou analyzovány (zjednodušená metoda, disku nebo API Staph).
výsledky
100 stafylokokových izolátů bylo testováno čtyřmi navrženými metodami., Výsledky získané referenční metodou (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) byly porovnány s výsledky získanými modifikovanými metodami a systémem API Staph.
tabulka III ukazuje dohodu o identifikaci mezi analyzovanými testy a referenční metodou. Zjednodušená metoda a metoda disku ukázaly 100 a 99% pozitivitu ve srovnání s referenční metodou,zatímco toto procento bylo 84% pro systém API Staph. Z 16 izolátů s nesouhlasem identifikace metodou API Staph, 10 (62.,5%) ukázala správnou identifikaci, ale s % ID 7,1 až 31%, nižší než přijatelná hodnota.
zjednodušená metoda provádí ve dvou krocích se neliší od referenční metody z hlediska identifikace CNS druhů. Na rozdíl od jiných metod, disk metoda ukázala nepřesné identifikace a chybně identifikován S. hominis napětí (6.5%) v důsledku non-kvašení sacharózy na disku, což vede k zařazení tohoto kmene jako S. caprae. U ostatních druhů nebyla pozorována žádná nesoulad.,
největší rozdíl byl pozorován mezi referenční metodou a API Staph systému, při druhém způsobu není přesně identifikovat 1 S. epidermidis napětí (označené jako S. lugdunensis), 3. S. haemolyticus kmeny (2 identifikována jako S. aureus a 1 jako S. hominis), 4. S. hominis kmeny (2 identifikována jako S. lugdunensis, 1 jako S. haemolyticus a 1 jako S. aureus), a 8. S. warneri napětí (3 označeny jako S. lugdunensis, 2 jako S. haemolyticus, 2 jako S. hominis a 1 jako S. saprophyticus) (Tabulka III).,
DISKUSE
CNS jsou mikroorganismy, nejčastěji izolovány z krevních kultur, což představuje vážný zdravotní problém v mnoha rozvojových zemích a také vyvinul (Renneberg et al. 1995). Některé studie naznačují souvislost mezi S. epidermidis a nozokomiálních infekcí (Vuong & Otto 2002) se tento druh byl identifikován v 74 až 92% pacientů s bacteremias způsobených CNS (Martin et al. 1989). Jiné studie však uvádějí řadu infekcí způsobených jinými druhy CNS (Herwaldt et al. 1996), především s., haemolyticus, který je druhým nejčastěji detekovaným druhem (Bannerman 2003). Od CNS jsou etiologické agens řady infekčních procesů, identifikaci těchto mikroorganismů je důležité pro určení jejich physiopathological vlastnosti a klinický význam a pro epidemiologické studie, a vedl k zveřejnění různé studie, analýza metody identifikace těchto bakterií (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, De Paulis et al. 2003).,
V této studii, metody upravený v naší laboratoři přinesla dobré výsledky, pokud jde o správnou klasifikaci CNS druhů ve srovnání s referenční metodou, s 100% dohoda dodržována, pro zjednodušený modifikované metody a 99% dohoda o metodu disku.
zjednodušená metoda pomocí identifikace navrhovaného (viz Obrázek) vedla k identifikaci S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis, a. S. simulans v jednom kroku, s použitím celkem sedm biochemické testy, číslo nižší než zaměstnaných v referenční metoda (16 testů)., Od S. epidermidis je nejčastěji izolovaných druhů, 70 až 90% kmenů (Bannerman 2003) izolovaných v klinické laboratoři mohou být identifikovány pomocí snížení počtu testů.
S ohledem na inkubační dobu, výsledky ukázaly, že 91% kmenů analyzovaných ve studii fermentované druhově specifické cukru do 48 h inkubace při 37ºC., Ostatní kmeny (9%) pozitivní test na kvašení vzhledem cukrů po 72 h inkubace, což dokazuje význam inkubační cukru, kvašení testy nejméně 72 h aby bylo možné správně identifikovat tyto mikroorganismy.
identifikaci S. cohnii, S. schleiferi poddruh schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus a S. lugdunensis požadované provedení dva nebo tři další biochemické testy, označované jako druhý krok, který se lišil podle výsledku v prvním kroku zjednodušené metody., Nicméně, 20 (37.7%) kmenů, které vyžaduje druhý krok pro jejich identifikaci fermentované trehalosa do 24 h, což umožní před pokračováním na další testy. Delší dobu bylo potřeba určit, S. cohnii, S. schleiferi poddruh schleiferi a S. caprae, od druhého kroku nutné pro identifikaci těchto druhů zařazených dusičnanů snížení test, jehož výsledek je k dispozici pouze po 48 h. Tato skutečnost však nemá ve skutečnosti mít za následek zpoždění v diagnostice CNS vzhledem k frekvenci těchto druhů v klinických vzorcích je nízká.,
disku metodou bylo také zjištěno, že být velmi účinné a praktické, protože nevyžaduje předchozí přípravu cukrů, čímž se zabrání ztrátě kultivační média, kromě dosažení vysoké dohoda v identifikaci CNS s referenční metodou.
komerční API Staph kit ukázal nejnižší přesnost v identifikaci CNS mezi metody studoval (84% shoda), v dohodě s studií (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995).
s. warneri a s. hominis byly nejobtížnějším druhem, který bylo možné identifikovat. Bannerman et al., (1993) také hlášeny nižší přesnost při identifikaci těchto druhů. Ve studii ieven et al. (1995), s.hominis byl identifikován s nejmenší přesností systémem API ID 32 Staph. Toto zjištění lze vysvětlit nedostatkem doplňkových testů, jako je rezistence na novobiocin, anaerobní růst produkce thioglykolátu a hemolyzinu.
v případě s., haemolyticus, nesprávné identifikaci pomocí API Staph systém může být vysvětleno skutečností, že kit není naznačují, hemolyzinový výroby jako doplňkový test, který by být nezbytné pro identifikaci S. haemolyticus kmenů.
tři (3%) ze 100 kmenů analyzovaných systémem API Staph byly identifikovány jako s.aureus, což také uvádí Renneberg et al. (1995). Bylo zjištěno, že souprava je v těchto případech neúčinná, protože nepožadovala výsledek základního a nejrozšířenějšího testu identifikace s. aureus, tj.,, koagulázový test (Koneman et al. 1997).
podle Piccolomini et al. (1994), nízká dohoda mezi API Staph a tradičním biochemickým testem pro identifikaci CNS lze vysvětlit použitím různých inkubačních časů, koncentrací substrátu a/nebo markerů citlivosti.,
Na závěr dvě metody upravený v naší laboratoři bylo zjištěno, že být velmi efektivní pro běžné použití vzhledem k jejich vysoké citlivosti a specifičnosti ve srovnání s referenční metodou, kromě toho, že vyžaduje méně zkoušek, a tak je úspornější a rychlejší než standardní metody. Přestože vyžadoval kratší inkubační dobu (18 h), systém API Staph vykazoval nižší citlivost při identifikaci některých druhů., Identifikace druhů CNS bude nepochybně usnadněna a podporována dostupností jednoduchého, levného a přesného postupu, zejména v místech s omezenými zdroji.
poděkování
společnosti bioMérieux za darování souprav API Staph používaných v této studii.
Baker JS 1984. Srovnání různých metod diferenciace stafylokoků a mikrokoků. J Clin Microbiol 19: 875-879.
Bannerman TL 2003. Staphylococcus, Micrococcus, a další kataláza-pozitivní koky, které rostou aerobně., V PR Murray, EJ Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller, RH Yolken (eds), Manual of Clinical Microbiology, American Society Microbiology, Washington, s. 384-404.
Bannerman TL, Kleeman KT, Kloos WE 1993. Hodnocení Gram-pozitivní identifikační karty Vitek Systems pro identifikaci druhů koagulázy-negativních stafylokoků. J Clin Microbiol 31: 1322-1325.
De Paulis AN, Predari s, CHAZARRETA CD, Santoianni JE 2003. Pět-test jednoduché schéma pro identifikaci druhů na úrovni klinicky významné koagulázy-negativní stafylokoky. J Clin Microbiol 41: 1219-1224.,
Grant CE, Sewell DL, Pfaller M, Bumgardner RVS, Willians JA 1994. Vyhodnocení dvou komerčních systémů pro identifikaci koagulázy-negativního stafylokoku na druhovou úroveň. Diag Microbiol Infikovat Dis 18: 1-5.
Herwaldt LA, Geiss M, Kao C, Pfaller M 1996. Pozitivní hodnota izolace koagulázy-negativní stafylokoky z krevních kultur. Clin Infikovat Dis 22: 14-20.
Huebner J, Goldmann DA 1999. Koaguláza-negativní stafylokoky: role jako patogeny. Annu Rev Med 50: 223-236.
Ieven m, Verhoeven J, Pattyn SR, Goossens H 1995., Rychlá a ekonomická metoda pro identifikaci druhů klinicky významné koagulázy-negativní stafylokoky. J Clin Microbiol 33: 1060-1063.
Kloos WE, Bannerman TL 1994. Aktualizace klinického významu koagulázy-negativních stafylokoků. Clin Microbiol Rev 7: 117-140.
Kloos WE, Schleifer KH 1975. Zjednodušená schéma pro rutinní identifikaci lidských druhů stafylokoků. J Clin Microbiol 1: 82-88.
Knapp CC, Washington JA 1989., Hodnocení trehalosa-mannitol vývar pro diferenciaci Staphylococcus epidermidis od ostatních koaguláza-negativní druhy stafylokoků. J Clin Microbiol 27: 2624-2626.
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC 1997. Barevný Atlas a učebnice diagnostické mikrobiologie, 5.ed., Lippincott, Philadelphia, 1395 stran.
Kwok AYC, Chow AW 2003. Fylogenetická studie druhů stafylokoků a Makrokoků na základě částečných genových sekvencí hsp60. Int J Syst Evol Microbiol 53: 87-92.
Martin MA, Pfaller MA, Wenzel RP 1989., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern Med 110: 9-16.
Osmon DR, Sampathkumar P, Cockerill FR 2000. Prosthetic joint infection due to Staphylococcus lugdunensis. Mayo Clinic Proceedings 75: 511-512.
Perl TM, Rhomberg PR, Bale MJ, Fuchs PC, Jones RN, Koontz FP, Pfaller MA 1994. Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diag Microbiol Infect Dis 18: 151-155.
Piccolomini R, Catamo G, Picciani C, D“Antonio D 1994., Hodnocení Staph-systému 18-R pro identifikaci stafylokokových klinických izolátů na druhovou úroveň. J Clin Microbiol 32: 649-653.
Renneberg J, Rieneck k, Gutschik e 1995. Vyhodnocení staph ID systému a Staph Zym systému pro identifikaci koagulázy-negativní stafylokoky. J Clin Microbiol 33: 1150-1153.
Sox HC 1986. Teorie pravděpodobnosti při použití diagnostických testů. Úvod do kritického studia literatury. Ann Stážista Med 104: 60-66.
Trülzsch K, Rindera H, Trèek J, Bader L, Wilhelm U, Heesemann J. 2002., „Staphylococcus pettenkoferi“, a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diag Microbiol Infect Dis 43: 175-182.
Vuong C, Otto M 2002. Staphylococcus epidermidis infections. Microb Infect 4: 481-489.