af metoder til identifikation af coagulase-negative stafylokokker
BIOKEMI KARAKTERISERING
Sammenligning af metoder til identifikation af coagulase-negative stafylokokker
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasilien
ABSTRAKT
Coagulase-negative stafylokokker (CNS) identifikation af arter er stadig svært for de fleste kliniske laboratorier., Den foreslåede ordning af Kloos og Schleifer og modificeret af Bannerman er reference metode, der bruges til identifikation af stafylokokker arter og underarter; men denne metode er relativt arbejdskrævende for rutinemæssig brug, da det kræver anvendelse af en lang række biokemiske tests. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at sammenligne fire metoder, dvs. referencemetoden, API Staph-systemet (biomririeu.) og to metoder modificeret fra referencemetoden i vores laboratorium (forenklet metode og diskmetode) til identifikation af 100 CNS-stammer., Sammenlignet med referencemetoden identificerede den forenklede metode og disk-metoden korrekt henholdsvis 100 og 99% af CNS-arten, mens denne sats var 84% for API Staph-systemet. Ukorrekte identifikation af API Staph metode, der blev observeret for Staphylococcus epidermidis (2.2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37.5%), og S. warneri (47.1%)., Den forenklede metode ved hjælp af simpel identifikation ordning, der er foreslået i den foreliggende undersøgelse blev fundet for at være effektiv for alle stammer, der er testet med 100% sensitivitet og specificitet, og viste sig at være tilgængelig alternativ til identifikation af stafylokokker, tilbyder, højere driftssikkerhed og lavere omkostninger, end de i øjeblikket tilgængelige kommercielle systemer. Denne metode ville være meget nyttig i klinisk mikrobiologisk laboratorium, især på steder med begrænsede ressourcer.,
Nøgle ord: coagulase-negative stafylokokker – metoder – identifikation – API Staph
Fyrre-arter af slægten Staphylococcus er blevet identificeret hidtil (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, en coagulase-positive arter, som producerer en række andre enzymer og toksiner, er det bedst kendte og har ofte været involveret i ætiologien af en række infektioner og forgiftninger i dyr og mennesker, der henviser til, at coagulase-negative stafylokokker (CNS), der repræsenterer et flertal af arter, har været anset for at være blødrådsakterier eller sjældent sygdomsfremkaldende (Kloos & Schleifer 1975)., I løbet af de sidste ti år, men CNS er blevet anerkendt som ætiologisk agenter for en række infektiøse processer, der repræsenterer de mikroorganismer, som oftest er isoleret fra blod (Huebner & Goldmann 1999).
omkring halvdelen af CNS-arter koloniserer naturligt mennesker, og i øjeblikket betragtes de i det væsentlige opportunistiske etiologiske midler, der hersker i adskillige organiske situationer for at producere alvorlige infektioner (Bannerman 2003)., Fremkomsten af CNS, som patogener af forskellige infektioner kan være et resultat af den stigende brug af invasive procedurer, såsom intravaskulære katetre og proteser til patienter, der gennemgår intensiv behandling, immunkompromitterede patienter, præmature børn, patienter med neoplasier, og transplanterede patienter (Kloos & Bannerman, 1994).
de arter, der oftest forårsager sygdomme hos mennesker, er S., epidermidis (bakteriæmi, infektioner på grund af implanterede medicinske enheder såsom proteser og katetre, infektion af kirurgiske sår, peritonitis hos patienter i kontinuerlig peritonealdialyse, osteomyelitis, endophthalmitis osv.), S. haemolyticus (endocarditis, peritonitis, septikæmi, og infektioner i urinvejene, sår, knogler, og led), og S. saprophyticus (urinvejsinfektioner og septicemic processer). Andre væsentlige opportunistiske patogener omfatter S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus, og S. saccharolyticus (Bannerman, 2003). S., lugdunensis synes at være forbundet med endocarditis efter implantation af protese ventiler, med peritonitis, med bløde væv, infektion, og med vertebrale osteomyelitis (Osmon et al. 2000).
I betragtning af de kendte sygdomsfremkaldende potentiale CNS inden for hospitalet miljøet, interesse om de forskellige arter, der er relateret til infektion og deres toksigent potentiale og virulens er steget over de sidste ti år, og det har ført til offentliggørelsen af forskellige undersøgelser på disse aspekter., På trods af den voksende karakterisering af CNS-infektioner identificeres disse mikroorganismer imidlertid ikke i kliniske mikrobiologiske laboratorier. Ordningen foreslået af Kloos og Schleifer (1975) og modificeret af Bannerman (2003) er den konventionelt anvendte metode; Denne metode er imidlertid relativt besværlig til rutinemæssig brug, da der kræves et stort antal biokemiske test., I de fleste rutinelaboratorier identificeres stafylokokker baseret på morfologiske aspekter af kolonierne, gramfarvning og katalase-og koagulaseproduktion, som kun tillader klassificering af stafylokokker i S. aureus og ikke-S. aureus isolater, hvor sidstnævnte blot klassificeres som CNS.
udviklingen af metoder til identifikation af stafylokokarter og underarter tillader klinikere at indhente oplysninger om de forskellige CNS, der er til stede i kliniske prøver, og at betragte dem som etiologiske midler til infektiøse processer., Nøjagtig identifikation af CNS er nødvendig for at kunne forudsige hver enkelt klinisk isolats potentielle patogenicitet eller antibiotikas modtagelighed på et tidligt tidspunkt og for at klarlægge hver enkelt Arts kliniske betydning. Gentagne CNS-isolater fra patienter med invasive sygdomme bør identificeres for at muliggøre en sammenligning af stammerne. På den anden side er artidentifikation en forudsætning, inden der indtastes procedurer for epidemiologiske undersøgelser.,
i de senere år er der udviklet flere kommercielle systemer til hurtig identifikation af stafylokokker som et alternativ til de klassiske identifikationsprotokoller (Bannerman 2003). Imidlertid udgør disse diagnostiske systemer problemer som omkostninger og inkubationstid, giver ofte upålidelige resultater (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Derudover blev mange af disse kits designet til identifikation af alle kendte CNS-arter (dvs.kliniske, veterinære og alimentære isolater) og er således ikke særlig specifikke., Baseret på ovenstående betragtninger, og i lyset af behovet for en hurtig, enkel og pålidelige metoder, formålet med denne undersøgelse var at sammenligne fire teknikker til identifikation af CNS, dvs, en reference metode (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), den kommercielle API Staph system, og to metoder, der er ændret fra den reference metode i vores laboratorium til at udvikle alternative identifikationsmetoder, der kombinerer enkelthed, pålidelighed og lave omkostninger især på steder med begrænset ressourcer.,
MATERIALER OG METODER
Isolater – Et-hundrede CNS-isolater, der er opnået fra kliniske prøver af patienter indlagt på rigshospitalet det sundhedsvidenskabelige Fakultet, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu Campus, blev undersøgt. Stammer blev isoleret som beskrevet af Koneman et al. (1997). identifikation af CNS-isolaterne opnået fra kliniske prøver blev belagt på blodagar og gram farvet for at garantere deres renhed og bevarelse af deres morfologi og specifik farvning., Efter bekræftelse af disse egenskaber blev isolaterne sendt til katalase-og koagulase-testene. Staphylococcus var differentieret fra Micrococcus arter på grundlag af oxidation og fermentering af glucose, modstand til at bacitracin (0.04 U) angives ved, at fraværet af en hæmning halo eller tilstedeværelsen af en hæmning halo måler op til 9 mm i diameter, og modtagelighed for furazolidone (100 mg) karakteriseret ved hæmning zoner måling af 15 til 35 mm i diameter (Baker 1984).
de fire metoder, der er beskrevet nedenfor, blev anvendt til identifikation af CNS., Følgende internationale reference CNS stammer blev brugt som kontrol: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), og S. saprophyticus (ATCC 15305).,
Reference metode foreslået af Kloos og Schleifer (1975) og Bannerman (2003) – Denne metode består af en række biokemiske tests, der bestemmer udnyttelse af det sukker, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, maltose, mannitol, laktose, xylitol, ribose, fructose, og mannose, produktion af hemolysin, nitrat reduktion, tilstedeværelse af urease og ornithin decarboxylase, og modstand mod novobiocin kendetegnet ved en hæmning glorie af op til 16 mm. Oplæsning af de tests, der blev opnået efter 24, 48 og 72 h inkubation ved 37ºC i en luft-inkubator.,
API Staph – API Staph system (biomririeu.) er et brugsklart testbatteri bestående af 20 biokemiske tests, hvortil der tilsættes en homogen bakteriesuspension ved 0,5 McFarland turbiditet. Efter 24 timers inkubation ved 37CC og tilsætning af VP (VP1 og VP2), NIT (NIT1 og NIT2) og PAL (andym A og BYM B) reagenser, der ledsager kittet, blev reaktionerne fortolket, og mikroorganismer blev identificeret ved hjælp af det analytiske katalog., Identifikation er baseret på et numerisk system, der består af syv cifre, der giver procent identifikation (%- ID), med en værdi > 80% er acceptabelt.
modificerede metoder – to identifikationsmetoder modificeret i vores laboratorium blev anvendt (forenklet metode og disk metode). Den forenklede metode blev opdelt i to trin. Under det første trin blev fermentering af thiylose, saccharose, trehalose, maltose og mannitol, produktion af hæmolysin og anaerob vækst i thioglycolat testet (tabel I)., De test, der blev anvendt i det andet trin, varierede i henhold til de resultater, der blev opnået i det første identifikationstrin efter 72-h inkubation ved 37 .c. Den supplerende test, der anvendes i det andet trin (når det er nødvendigt), er angivet i Tabel II.
Den disk metode bestod af følgende tests: gæring af arabinose, saccharose, trehalose, maltose, mannitol og laktose, nitrat reduktion, produktion af hemolysin, test for urease og ornithin decarboxylase, og modstand mod novobiocin., Til sukkerfermenteringstesten blev kommercielt tilgængelige diske, der var specifikke for hvert sukker, anbragt i rør indeholdende 2, 5 ml Lilla Bouillonbasemedium. Bakteriesuspensioner blev inokuleret som beskrevet af Kloos og Schleifer (1975). Aflæsninger for de to metoder blev opnået efter 24, 48 og 72 h inkubation ved 37CC, og CNS-arter blev identificeret i henhold til identifikationsskemaet foreslået i figuren.,
de Statistiske analyser til At bestemme den grad af enighed mellem de metoder, der anvendes til identifikation af CNS (forenklet metode, disk metode og API Staph) og reference metode (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), følsomhed og specificitet af testen (Sox 1986) blev vurderet som følger.,
følsomhed: andel af CNS-stammer, der testede positivt for en bestemt art ved referencemetoden, og som blev identificeret som den samme art ved den analyserede metode (forenklet metode, disk eller API Staph).
specificitet: andel af CNS-stammer, der testede negativt for en bestemt art ved referencemetoden, og som også var negative for den samme art, når de blev testet ved den analyserede metode (forenklet metode, disk eller API Staph).
resultater
de 100 stafylokokkisolater blev testet ved de fire foreslåede metoder., Resultaterne opnået med referencemetoden (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) blev sammenlignet med dem, der blev opnået med de modificerede metoder og API Staph-systemet.
tabel III viser aftalen i identifikation mellem de analyserede assays og referencemetoden. Den forenklede metode og diskmetoden viste 100 og 99% positivitet sammenlignet med referencemetoden, mens denne procentdel var 84% for API Staph-systemet. Af de 16 isolater med uenighed om identifikation ved API Staph metode, 10 (62.,5%) viste korrekt identifikation, men med en% ID på 7,1 til 31%, lavere end den acceptable værdi.
den forenklede metode, der blev udført i to trin, adskiller sig ikke fra referencemetoden med hensyn til identifikation af CNS-arter. I modsætning til de andre metoder, disken metode viste ukorrekte identifikation og fejlagtigt identificeret en S. hominis stamme (6.5%) på grund af den ikke-gæring af saccharose på den disk, der fører til klassificering af denne stamme, som S. caprae. Der blev ikke observeret inkongruens for de andre arter.,
Den største forskel blev observeret mellem reference metode og API Staph system, med sidstnævnte metode ikke præcist udpege 1 S. epidermidis stamme (identificeret som S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus stammer (2, der er identificeret som S. aureus og 1 som S. hominis), 4 S. hominis stammer (2, der er identificeret som S. lugdunensis, 1, da S. haemolyticus og 1 som S. aureus), og 8 S. warneri stamme (3, der er identificeret som S. lugdunensis, 2 som S. haemolyticus, 2, da S. hominis og 1 som S. saprophyticus) (Tabel III).,
diskussion
CNS er de mikroorganismer, der oftest isoleres fra blodkulturer, hvilket repræsenterer et alvorligt helbredsproblem i mange udviklingslande og også udviklet (Renneberg et al. 1995). Nogle undersøgelser har antydet en sammenhæng mellem S. epidermidis og nosokomielle infektioner (Vuong & Otto 2002) med denne art, der er identificeret i 74 og 92% af patienter med bacteremias forårsaget af CNS (Martin et al. 1989). Andre undersøgelser har imidlertid rapporteret en række infektioner forårsaget af andre CNS-arter (her .aldt et al. 1996), hovedsagelig S., haemolyticus, som er den næsthyppigst fundne Art (Bannerman 2003). Da CNS er ætiologisk agenter for en række infektiøse processer, identifikation af disse mikroorganismer er vigtigt for bestemmelse af deres physiopathological egenskaber og klinisk betydning og for epidemiologiske undersøgelser, og det har ført til offentliggørelsen af forskellige undersøgelser, analysere metoder til identifikation af disse bakterier (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, De Paulis et al. 2003).,
i den foreliggende undersøgelse gav de metoder, der blev ændret i vores laboratorium, gode resultater med hensyn til den korrekte klassificering af CNS-arter sammenlignet med referencemetoden, idet 100% – aftalen blev observeret for den forenklede modificerede metode og 99% – aftalen for diskmetoden.
Den forenklede metode ved hjælp af identifikation-ordningen her (Figur), og førte til identifikation af S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis, og S. simulans i et enkelt trin, ved hjælp af i alt syv biokemiske tests, et lavere nummer end det, der er ansat i reference metode (16 prøver)., Da S. epidermidis er den hyppigst isolerede art, kan 70 til 90% af stammerne (Bannerman 2003) isoleret i det kliniske laboratorium identificeres ved hjælp af et reduceret antal tests.
Med hensyn til inkubationstid viste resultaterne, at 91% af de stammer, der blev analyseret i undersøgelsen, fermenterede det artsspecifikke sukker inden for 48 timer efter inkubation ved 37 .c., De andre stammer (9%) testede positivt for fermentering af givne sukkerarter efter 72 timers inkubation, hvilket demonstrerede betydningen af en inkubation af sukkerfermenteringstestene på mindst 72 timer for korrekt at identificere disse mikroorganismer.
identifikation af S. cohnii, S. schleiferi underarter schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus, og S. lugdunensis kræves udførelse af to eller tre yderligere biokemiske tests, der er nævnt som det andet skridt, som varierede i forhold til resultatet, der er opnået i det første trin af en forenklet metode., Imidlertid 20 (37,7%) stammer, der krævede det andet trin for deres identifikation fermenteret trehalose inden for 24 timer, hvilket tillader forudgående fortsættelse af de yderligere test. En længere tid, der var nødvendig for at identificere S. cohnii, S. schleiferi underarter schleiferi, og S. caprae, da det andet skridt er nødvendige for identifikation af disse arter, der er optaget nitrat reduktion test, hvis resultat er kun tilgængelig, efter 48 h. Men dette faktum gør faktisk ikke medføre en forsinkelse i diagnosticering af CNS da hyppigheden af disse arter i kliniske prøver er lav.,
diskmetoden viste sig også at være meget effektiv og praktisk, da den ikke kræver tidligere tilberedning af sukkerarter, hvilket forhindrer tab af kulturmedier, ud over at nå høj enighed om identifikationen af CNS med referencemetoden.
det kommercielle API Staph kit viste den laveste nøjagtighed i identifikationen af CNS blandt de undersøgte metoder (84% aftale) i overensstemmelse med undersøgelserne af (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995).
S. S.arneri og S. hominis var de sværeste arter at identificere. Bannerman et al., (1993) rapporterede også en lavere nøjagtighed i identifikationen af disse arter. I undersøgelsen af Ieven et al. (1995) blev S. hominis identificeret med den mindste nøjagtighed af API ID 32 Staph-systemet. Dette fund kan forklares med manglen på komplementære test såsom novobiocinresistens, anaerob vækst i thioglycolat og hæmolysinproduktion.
I tilfælde af S., haemolyticus, forkert identifikation af API Staph-systemet kan forklares ved, at kittet ikke antyder hæmolysinproduktion som en komplementær test, hvilket ville være vigtigt for identifikation af S. haemolyticus-stammer.
tre (3%) af de 100 stammer, der blev analyseret af API Staph-systemet, blev identificeret som S. aureus, et faktum også rapporteret af Renneberg et al. (1995). Kittet viste sig at være ineffektivt i disse tilfælde, da det ikke anmodede om resultatet af den grundlæggende og mest accepterede test til identifikation af S. aureus, dvs.,, koagulase testen (Koneman et al. 1997).
ifølge Piccolomini et al. (1994) kan den lave aftale mellem API Staph og den traditionelle biokemiske test til identifikation af CNS forklares ved anvendelse af forskellige inkubationstider, substratkoncentrationer og/eller følsomhedsmarkører., som konklusion viste de to metoder, der blev ændret i vores laboratorium, at være yderst effektive til rutinemæssig brug på grund af deres høje følsomhed og specificitet sammenlignet med referencemetoden, ud over at kræve færre test og dermed være mere økonomiske og hurtigere end standardmetoden. På trods af at der kræves en kortere inkubationstid (18 h), viste API Staph-systemet en lavere følsomhed ved identifikation af nogle arter., Uden tvivl vil CNS-artsidentifikation blive faciliteret og opmuntret af tilgængeligheden af en enkel, billig og nøjagtig procedure, især på steder med begrænsede ressourcer.
anerkendelser
til biomririeu.for donation af API Staph kits anvendt i den foreliggende undersøgelse.Baker JS 1984. Sammenligning af forskellige metoder til differentiering af stafylokokker og mikrokokker. J Clin Microbiol 19: 875-879.
Bannerman tl 2003. Staphylococcus, Micrococcus og andre katalase-positive cocci, der vokser aerobt., I PR Murray, EJ Baron, JH Jørgensen, MA Pfaller, RH Yolken (eds), Manual of Clinical Microbiology, American Society Microbiology, ,ashington, p. 384-404.
Bannerman, TL, Kleeman KT, Kloos VI 1993. Evaluering af Vitek Systems Gram-positive identifikationskort til artsidentifikation af koagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 31: 1322-1325.
de Paulis AN, Predari s, Cha .arreta CD, Santoianni JE 2003. Fem-test enkel ordning for ART-niveau identifikation af klinisk signifikant koagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 41: 1219-1224.,
Grant CE, Sewell, DL, Pfaller M, Bumgardner AUTOCAMPERE, Willians JA 1994. Evaluering af to kommercielle systemer til identifikation af koagulase-negativ stafylokokker til artsniveau. Diag Microbiol Inficerer Dis 18: 1-5.
Her 1996aldt LA, Geiss M, Kao C, Pfaller m 1996. Den positive værdi af isolering af koagulase-negative stafylokokker fra blodkulturer. Clin Inficere Dis 22: 14-20.
Huebner J, Goldmann da 1999. Coagulase-negative stafylokokker: rolle som patogener. Annu Rev Med 50: 223-236.
Ieven M, Verhoeven J, Pattyn SR, Goossens H 1995., Hurtig og økonomisk metode til artsidentifikation af klinisk signifikant koagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 33: 1060-1063.
Kloos vi, Bannerman tl 1994. Opdatering om klinisk betydning af koagulase-negative stafylokokker. Clin Microbiol Rev 7: 117-140.
Kloos VI, Schleifer KH 1975. Forenklet ordning for rutinemæssig identifikation af humane stafylokokker arter. J Clin Microbiol 1: 82-88. Knapp cc, 1989ashington ja 1989., Evaluering af trehalose-mannitol bouillon til differentiering af Staphylococcus epidermidis fra andre koagulase-negative stafylokokarter. J Clin Microbiol 27: 2624-2626.
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC 1997. Farveatlas og lærebog for diagnostisk Mikrobiologi, 5.udg., Lippincott, Philadelphia, 1395 s.
K ,ok AYC, cho.a 2003 2003. Fylogenetisk undersøgelse af Staphylococcus-og Makrococcus-arter baseret på partielle hsp60-gensekvenser. Int J Syst Evol Microbiol 53: 87-92.
Martin ma, Pfaller MA, Wenen .el RP 1989., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern Med 110: 9-16.
Osmon DR, Sampathkumar P, Cockerill FR 2000. Prosthetic joint infection due to Staphylococcus lugdunensis. Mayo Clinic Proceedings 75: 511-512.
Perl TM, Rhomberg PR, Bale MJ, Fuchs PC, Jones RN, Koontz FP, Pfaller MA 1994. Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diag Microbiol Infect Dis 18: 151-155.
Piccolomini R, Catamo G, Picciani C, D”Antonio D 1994., Evaluering af Staph-System 18-R til identifikation af stafylokok kliniske isolater til artsniveauet. J Clin Microbiol 32: 649-653. Renneberg J, Rieneck K, gutschik e 1995. Evaluering af Staph ID-system og Staph IDYM-system til identifikation af koagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 33: 1150-1153.
so 1986 HC 1986. Sandsynlighedsteori i brugen af diagnostiske tests. En introduktion til kritisk undersøgelse af litteratur. Ann Intern 104ith 104: 60-66.
Trülzsch K, Rinder H, Trèek J, Bader L, Wilhelm U, Heesemann J 2002., “Staphylococcus pettenkoferi”, a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diag Microbiol Infect Dis 43: 175-182.
Vuong C, Otto M 2002. Staphylococcus epidermidis infections. Microb Infect 4: 481-489.