Tæller celler ved hjælp af et hæmocytometer
Figur 1. Hemocytometer gitterlinjer.
Hæmocytometerdiagram, der angiver et af sætene på 16 firkanter, der skal bruges til tælling.
Weebinar transkript
tælling af celler tillader nøjagtig bestemmelse af celletal og derfor konsistens mellem eksperimenter. Denne video vil skitsere proceduren for at tælle både suspension og adhæsionsceller ved hjælp af et hæmocytometer.
før arbejdet påbegyndes, sprøjtes indersiden af det laminære strømningssikkerhedsskab grundigt med desinfektionsmiddel og tørres af med væv., Bortskaf brugt væv i den relevante affaldsspand. Sprøjt derefter indersiden af hætten med 70% ethanol og tør den af med væv. Emhætten er nu ren og klar til brug. Fjern celledyrkningsmedier og trypsin fra køleskabet, og placer i en befugtet, 37 grader C, kuldio .id inkubator for at varme. I mellemtiden skal du se på cellerne, der skal tælles ved hjælp af et mikroskop for at kontrollere eventuelle visuelle tegn på bakterie-og svampekontaminering. Spray medieflasker og pipetter med 70% ethanol, før du spiller i det laminære Flo. – sikkerhedsskab.,
Ved suspensionsceller omrøres kolben forsigtigt for at sikre, at cellerne er godt blandet. Før de får en chance for at slå sig ned, skal du tage en 0, 5 milliliter prøve af cellesuspension og pipet i et sterilt eppendorf-rør. For vedhæftningsceller skal du fjerne eksisterende medier, vaske med stuetemperatur PBS og tilføje trypsin EDTA for at løsne cellerne. Se tabel et for de krævede mængder PBS og trypsin. Inkub ther cellerne i to til fem minutter i den befugtede 37 grader c, kuldio .id inkubator. Inkubationstiden skal optimeres til celletypen., Når alle celler løsnes, neutraliseres trypsin EDTA med varmt serum indeholdende vækstmedier, der passer til cellerne og kulturen. Se tabel et for de krævede mængder.
ophæng cellerne igen ved forsigtigt at pipette cellesuspensionen op og ned tre gange og overføre dem til et 50 ml rør. Centrifuger cellesuspensionen i fem minutter ved 1.000 omdrejninger pr. minut ved stuetemperatur., Supernatanten fjernes ved hjælp af en steril serologisk pipette, og cellepaletten suspenderes igen med 37-graders C-serum, der indeholder vækstmedier, til det oprindelige volumen af startkulturen. Ved hjælp af en fem milliliter steril pipettag og 0,5 milliliter prøve af cellesuspension og overfør til et sterilt eppendorf-rør.
for at tælle, skal du forberede engangshemocytometeret. Ved hjælp af en P2000 Gilson Pipet, tage 100 mikroliter suspension, og tilføje til 400 mikroliter trypan blå, Bemærk, .08% og blandes godt., Tag 100 mikroliter af trypan blue cell suspension mi., og rør forsigtigt en dråbe af suspensionen ind i brønden i tællekammeret, så kapillærvirkning kan trække prøven ind. Pas på ikke at overfylde tællekammeret. Se tælleområdet under en 10 gange forstørrelse ved hjælp af et inverteret mikroskop. Brug mikroskopet til at fokusere på et af de fire til fire gitter på hæmocytometeret og tælle cellerne negativt for trypanblå. Disse er levedygtige. Bemærk også, hvor mange celler der var positive for trypan blue., Disse celler er døde, og dette tal kan senere bruges til at beregne kulturens procentvise levedygtighed, hvis det kræves.
ved tælling skal du anvende et system, hvor celler kun tælles, når de er inden for en firkant eller på højre eller nederste grænselinje. Optag antallet af celler, der tælles i dette sæt på 16 firkanter, og flyt hæmocytometeret, indtil alle fire sæt på 16 firkanter på hæmocytometeret er talt, og deres værdier registreres., For at beregne cellekoncentrationen skal du tage det gennemsnitlige antal levedygtige celler i de fire sæt på 16 firkanter og multiplicere med 10.000 for at få antallet af celler pr. Multiplicer derefter dette med fem for at korrigere for den i fem fortynding fra trypan blue-tilføjelsen. Denne endelige værdi er antallet af levedygtige celler pr.,hvis dit levedygtige celletal for eksempel er 200.000 celler pr. milliliter i et volumen på 20 ml, og du vil se 10.000 celler i den nye kolbe, skal du overføre 50 mikroliter af din cellesuspension til den nye kolbe. Overfør det krævede volumen cellesuspension til den nye kolbe. Fyld op med medier og læg i inkubatoren.