Auswirkungen von Dimethylaminoethanol und Compound Amino Acid on D-Galactose-Induced Skin Aging-Modell der Ratte

Abstract

Eine anhaltende Traum des Menschen ist, zu stornieren oder zu verschieben aging. In dieser Studie, dimethylaminoethanol (DMAE) und compound amino acid (AA) in Mesotherapie untersucht wurden, die für Ihre potenziellen Anti-Aging-Effekte auf D-Galaktose-induzierte Hautalterung. 18 Tage nach der D-gal-Induktion wurde jede Ratte mit intradermaler Mikroinjektion von Kochsalzlösung, AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA bzw., Nach 42 Tagen nach der Behandlung wurde die Hautwunde geerntet und untersucht. Die Messung der epidermalen und dermalen Dicke in 0,1% DMAE + AA-und 0,2% DMAE + AA-Gruppen erschien signifikant dicker als Alterungskontrollratten. Keine Unterschiede fanden sich im Gewebe Wasser Inhalt zwischen den Gruppen. Hydroxyprolin in 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA und Schein-Kontrollgruppen war viel höher als alle anderen Gruppen. Die Kollagen-Typ-I -, Typ-III-und MMP-1-Expression war sowohl in 0,1% DMAE + AA-als auch in 0,2% DMAE + AA-Gruppen im Vergleich zur Alterskontrolle stark hochreguliert., Im Gegensatz dazu waren die TIMP-1-Expressionswerte verschiedener Alterungsgruppen im Vergleich zur Scheinkontrolle signifikant reduziert. Coinjektion von DMAE und AA in Zielgewebe hat deutliche Anti-Aging-Effekte auf D-Galactose induzierte Hautalterung Modell der Ratte.

1. Einführung

Antiaging ist ein ewiges Thema und Traum des Menschen., Altersbedingte Hautveränderungen sind unvermeidlich und umfassen Ausdünnung, Absacken, Faltenbildung, Elastizitätsverlust, Trockenheitsbereiche und einen umgekehrten Umsatz des Kollagen-Typ-I/III-Verhältnisses in der Haut, der sich als reduzierte Synthese von Kollagen Typ I, aber als hochregulierte Produktion von Kollagen Typ III darstellte . Derzeit hat die Mesotherapie das Interesse aller als Anti-Aging-Strategie geweckt., Es handelt sich um ein minimalinvasives Verfahren, das aus der intradermalen Mikroinjektion von pharmakologischen Substanzen wie Nährstoffen, Hormonen, Vitaminen, Enzymen und anderen Reagenzien besteht, die verdünnt wurden und direkt in die zu behandelnde Region verabreicht werden. Unter steriler und professioneller Manipulation verursacht die Mesotherapie sehr selten Probleme mit Hautinfektionen und Nekrosen, mit Ausnahme einiger geringfügiger Risiken wie Schwellungen und Schmerzen während der Injektion., Als sicheres, einfaches, weniger schmerzhaftes Verfahren, das zu den sogenannten „kosmetischen Verfahren zur Mittagszeit“ gehört, benötigt es keine Erholungszeit und ist perfekt für Profis und erfolgreiche Menschen im schnelllebigen modernen Leben .

Dimethylaminoethanol (DMAE), ein Analogon des B-Vitamin-Cholin und ein Vorläufer von Acetylcholin, wurde heute als aufregendes neues Hautpflegeprodukt wegen seiner akuten Wirkung von Anti-Aging, Anti-Funkeln und Hautfestigkeit mehr Aufmerksamkeit geschenkt. DMAE ist bekannt für den Einsatz in externen Anwendungen., In den randomisierten klinischen Studien hat sich gezeigt, dass 3% DMAE-Gesichtsgel sicher und wirksam bei der Milderung von Stirnlinien und periorbitalen feinen Falten sowie bei der Verbesserung der Lippenfülle und-form und des Gesamterscheinungs der Gesichtshaut ist . Eine Open-Label-Verlängerung der Studie zeigte auch, dass die langfristige Anwendung von DMAE-Gel für bis zu 1 Jahr mit einem guten Sicherheitsprofil verbunden war ., Die tropische Behandlung mit DMAE erfordert jedoch normalerweise eine hohe Dosis und Konzentration, um die epidermale Permeabilitätsbarriere zu passieren, was Bedenken hinsichtlich ihrer Toxizität, Nebenwirkungen und medizinischen Kosten hervorrufen kann. Es wurde berichtet, dass 2,5-10 mmol / ml DMAE eine vakuoläre Zytopathologie von in vitro kultivierten menschlichen Fibroblastenzellen verursachen könnten. Darüber hinaus zeigten Studien, dass die tropische Anwendung von 3% DMAE-Gel auch die vakuoläre Zytopathologie von Epidermiszellen des Kaninchenohrs verursachen könnte. Eine alternative Abgabe von DMAE ist erforderlich, um die relative Wirksamkeit zur Verbesserung der alternden Haut zu bewerten.,

Um mögliche Anti-Aging-Effekte von niedrig dosierten DMAE, die intradermal durch lokalisierte Mikroinjektion (Mesotherapie) verabreicht wurden, zu bewerten, wurden in dieser Studie Gewebestruktur und Kollagenstoffwechsel von D-gal induzierter alternder Haut gemessen. In der Zwischenzeit wurde auch die Coinjektion der zusammengesetzten Aminosäure (AA) untersucht, die zu einer verringerten Zelltoxizität durch DMAE-Injektion führte und zu einer lokalen Nährstoffversorgung führte. Ihr betrachteter Wirkmechanismus in der Haut wurde ebenfalls beschrieben.

2. Materialien und Methoden

2.1., Tiere

Männliche Wistar-Ratten wurden vom Institut für pharmazeutische Wissenschaften (Qingdao, China) gekauft. Alle Tiere wiegen zum Zeitpunkt der Operation 180-220 g. Tierpflege und experimentelles Protokoll wurden vom angeschlossenen Krankenhaus der Qingdao University Medical School Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

Insgesamt 80 Wistar-Ratten wurden zufällig in jede Versuchsgruppe eingeteilt (wie in Tabelle 1 beschrieben)., Tiere aus jeder Behandlungsgruppe, mit Ausnahme der Schein-Kontrollgruppe, erhielten 6 Wochen lang subkutane Injektion mit D-Galactose (D-gal) in einer Dosis von 125 mg/kg·d, um das Hautalterungsmodell der Ratte zu induzieren. 18 Tage nach der D-gal-Injektion wurde jede Ratte mit Chloralhydrat (0,25 ml pro 100 g Körpergewicht) betäubt und im Hüftbereich desinfiziert. Ein 3 cm runder Tätowierungsbereich wurde auf jeder Seite der Hüfte der Ratte vorgefertigt und dann einmal wöchentlich 4 Wochen lang unter Vollnarkose mit intradermaler Mikroinjektion von Kochsalzlösung (NS), AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA oder 0 behandelt.,2% DMAE + AA, beziehungsweise. Sowohl die Negativkontroll-als auch die Scheinkontrollgruppen erhielten genau den gleichen chirurgischen Eingriff, jedoch ohne untersuchte Behandlung. Nach 42 Tagen nach der Behandlung wurden alle Tiere eingeschläfert und Hautwunden durch Histologie, Messung des Wassergehalts, des Hydroxyprolingehalts und quantitative Echtzeit-PCR-Tests verglichen.

2.2. Histopathologie

Die Hautdicke wurde mit der Bildanalysesoftware SimplePCI (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) in mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Abschnitten gemessen., Die epidermale Dicke wurde von der Stratum corneum (SC) – Oberfläche bis zum Boden der Hautpapillen gemessen, während die dermale Dicke von der Oberseite der Papillen bis zu den tiefsten Teilen der retikulären Dermis gemessen wurde, bis Fettgewebe oder Muskel erreicht war. Unter der gleichen Vergrößerung wurden 5 einzelne Positionen zufällig ausgewählt, um die Hautdicke aus jedem von 5 Sichtfeldern pro Abschnitt zu messen. Mit Masson Trichrome Fleck aller Abschnitte wurden auch 5 verschiedene Sichtfelder zufällig ausgewählt und auf die Kollagenfaserdichte analysiert.

2.3., Messung des Wassergehalts

1 cm2 Die Hautwunde wurde geerntet und für das genaue Nassgewicht gemessen, gefolgt von 12 Stunden Backen bei 80°C, bevor das Trockengewicht gemessen wurde. Der Wassergehalt der Haut wurde nach der Formel des Prozentsatzes des Wassergehalts = ((Nassgewicht − Trockengewicht) ÷ Nassgewicht) × 100% berechnet.

2.4. Die Messung des Hydroxyprolingehalts

Der Hydroxyprolingehalt in der Hautwunde wurde gemäß dem Protokoll der Manufacture of Commercial Assay Kits (NANJING JIANCHEN biological engineering Co., LTD, Nanjing, China).

2.5., Quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)

Hautwunden wurden in TRIzol1 (Invitrogen) homogenisiert und die gesamte RNA wurde gemäß Herstellerprotokoll extrahiert. 1 µg Gesamt-RNA wurde Umgekehrt transkribiert in cDNA mit dem PrimeScript RT-Synthese-System (Takara Biotechnology/Takara Bio, Dalian, China). Mit diesen cDNA-Produkten wurde eine hochempfindliche quantitative PCR-Methode durchgeführt. Alle kundenspezifischen Primer und Sonden wurden auf ihre Effizienz validiert (siehe Tabelle 2)., Die 10 ml Reaktionsmischung enthielt 2x Power SYBR1 Green PCR Master Mix, 10-fach verdünnte cDNA und 0,2 mM jeder Grundierung. Das thermische Protokoll bestand aus einer 10-minütigen Polymeraseaktivierung bei 95°C, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95°C für 30 s, Primerglühen bei 55°C für 1 min und einer Verlängerung bei 72°C für 30 s. Die mRNA-Expressionsniveaus wurden auf die des endogenen Referenzgens β-Aktion normalisiert und als Foldveränderungen zu denen präsentiert, die aus alternden Kontrollhautproben erhalten wurden. ,

2.6. Statistical Analysis

Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant bei einer Wahrscheinlichkeit Niveau .

3. Ergebnisse

3.1. Histologische Veränderungen

Alternde Haut zeigte im Vergleich zu Scheinkontrollratten eine verringerte Dicke sowohl für Epidermis als auch für Dermis. Mit zunehmendem Alter reduzierte die Epidermis die Anzahl der Zellschichten, und die dermalen Kollagenfasern erwiesen sich als spärlich, schlank oder gebrochen. Im Vergleich zur Alterskontrolle waren diese histologischen Veränderungen jedoch in 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA und 0,2% DMAE-Gruppen stark verbessert (Abbildungen 1(a)-1(h)).

Bei Behandlung mit 0,1% DMAE + AA oder 0.,2% DMAE + AA, sowohl epidermale als auch dermale Dicke und Dichte der Kollagenfaser, waren signifikant erhöht gegenüber denen der Alterungskontrollgruppe. Darüber hinaus erhöhte 0,2% DMAE allein die epidermale Dicke und Dichte der Kollagenfaser im Vergleich zur Alterskontrolle signifikant. Dennoch wurden diese drei Parameter in allen Alterungsgruppen im Vergleich zu denen der Scheinkontrollgruppe stark herunterreguliert (Abbildungen 2 (a), 2(b) und 2(c))).

3.2. Wassergehalt in alternder Haut

Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede im Wassergehalt unter allen Gruppen(Abbildung 2 (d)).,

3.3. Hydroxyprolingehalt in alternder Haut

Der Hydroxyprolingehalt war bei alternder Haut, die sowohl mit 0,1% DMAE + AA als auch mit 0,2% DMAE + AA-Komplex behandelt wurde, stark erhöht, was im Vergleich zu allen anderen Alterungsgruppen signifikante Unterschiede aufwies. Interessanterweise erreichte der Hydroxyprolingehalt in der 0, 2% igen DMAE + AA-Gruppe ein Äquivalent zu dem der Scheinkontrolle, war jedoch signifikant höher als bei allen anderen 6-Alterungsgruppen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen 0.1% DMAE + AA und 0,2% DMAE + AA-Gruppen (Abbildung 2(e)).

3.4., Die mRNA-Expression der Zielgene Typ I, Typ III Procollagen, MMP-1 und TIMP-1

Die Kollagen-Typ-I-Expression war in Reaktion auf 0,1% DMAE + AA-und 0,2% DMAE + AA-Behandlungen stark hochreguliert, was keinen signifikanten Unterschied zu der der Scheinkontrolle zeigte. Jede der anderen Alterungsgruppen zeigte jedoch im Vergleich zu Scheinkontrollratten eine viel geringere Expression von Kollagen Typ I (Abbildung 3(a)). Wenn die Behandlung mit 0,1% DMAE + AA, 0.2% DMAE + AA, oder 0.,Allein 2% DMAE, Transkriptspiegel für Kollagen Typ III, waren gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht, jedoch signifikant geringer als bei der Scheinkontrolle (Abbildung 3(b)). Als potenzieller Schlüsselregulator bei der Hautalterung nahmen die MMP-1-Nachrichten als Reaktion auf eine Behandlung mit 0,1% DMAE + AA oder 0,2% DMAE + AA zu, was einen statistisch signifikanten Unterschied zu der der Alterskontrolle zeigte, jedoch keine Scheinkontrollratten (Abbildung 3 (c))). Im Gegensatz dazu wurden die Transkriptionswerte für TIMP-1 in allen Altersgruppen signifikant auf ein viel niedrigeres Niveau der Scheinkontrolle herunterreguliert (Abbildung 3 (d)).,

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 3

Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., Die Hautwunde wurde verarbeitet und auf die Expression von Kollagen Typ I (a), Kollagen Typ III (b), MMP-1 (c) und dessen Inhibitor sowie TIMP-1 (d) durch quantitative RT-PCR untersucht. Expressionsniveaus für jedes Targeting-Gen wurden zu endogenem Referenzgen normalisiert und als relative Werte (ΔΔCt) zu denen gemeldet, die von der Kontrollgruppe erhalten wurden. und † weisen auf einen signifikanten Unterschied () im Vergleich zur Negativkontrolle (Gruppe 1) bzw. zur Scheinkontrolle (Gruppe 8) hin.

4., Diskussion

Die Injektion von niedrig dosierter D-Galactose in die Rattenhaut könnte Veränderungen hervorrufen, die einer beschleunigten Alterung ähneln. In unseren Studien zeigte das Alterungsmodell der Ratte Haarfarbveränderungen, verminderte Aktivitäten und neurologische Beeinträchtigungen. Die histologischen Veränderungen der D-gal-induzierten alternden Haut werden als dünnere Epidermis mit reduzierten Zellschichten und spärlichen, schlanken oder gebrochenen Kollagenfasern in der Hautschicht dargestellt. Darüber hinaus zeigte diese alternde Haut im Vergleich zu normalem Hautgewebe einen geringeren Hydroxyprolingehalt und mRNA-Botschaften für Typ I, Typ III Kollagen, MMP-1 und TIMP-1., Alle diese Daten legen nahe, dass die Injektion von 125 mg/kg·d D-Galactose über 6 Wochen technisch machbar ist, um ein subakutes Alterungsmodell zur Nachahmung der alternden Haut des Menschen zu erstellen .

Unsere Studien zeigten, dass die Injektion von DMAE und AA den Hydroxyprolingehalt und die Kollagen-Typ-I-Expression von D-gal-induzierter alternder Haut erhöhte, die bei hoher Dosis von 0,2% DMAE + AA-Behandlung ungefähr das gleiche Niveau von normalem Hautgewebe erreichten. Die histologischen Veränderungen erschienen als erhöhte epidermale und dermale Dicke und dicht angeordnete dermale Kollagenfasern., Interessanterweise erhöhte die Mesotherapie durch Injektion von DMAE und AA die MMP-1-Genexpression in alternder Haut stark auf ein äquivalentes Niveau normaler Ratten, jedoch nicht für ihren Inhibitor von TIMP-1, der bei allen alternden Ratten signifikant herunterreguliert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Mesotherapie durch Injektion von DMAE und AA eine positive Regulation des Kollagenkatabolismus bei der Reparatur und Rekonstruktion alternder Haut spielte und den Alterungsprozess der Haut verzögerte., Frühere Studien zeigten die reduzierte Produktion von Kollagen Typ I und eine erhöhte Synthese von Kollagen Typ III und MMP-1 in alternder Haut ; Unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass die mRNA-Expression für Kollagen Typ III und MMP-1 bei der Alterskontrolle viel geringer war als bei normalen Ratten. Es kann sein, dass der Kollagenstoffwechsel einen anderen Weg zwischen normalen Hautveränderungen mit Alterung und D-gal-induziertem subakutem Hautalterungsmodell durchläuft. Unsere Studie zeigte auch, dass die Injektion von DMAE oder AA allein keine Auswirkungen auf den Hydroxyprolingehalt oder das Kollagen vom Typ I und MMP-1 bei alternder Haut zeigte., Diese Daten zeigen, dass die gleichzeitige Anwendung von DMAE und AA die einzige Möglichkeit sein könnte, ihre Anti-Aging-Wirkung in diesem D-gal-induzierten alternden Hautmodell auszuüben, indem der Kollagenstoffwechsel vom Typ I moduliert und die Struktur alternder Haut neu strukturiert wird.

Frühere Studien haben gezeigt, dass kultivierte Kaninchen-dermale Fibroblasten konzentrationsabhängig auf DMAE durch massive Vakuolisierung ansprachen. Die Epidermis des Außenohrs des Kaninchens war ebenfalls signifikant verdickt und zeigte eine deutliche perinukleäre Schwellung, die auf eine Vakuolisierung als Reaktion auf die topische Anwendung von 3% DMAE hinweist., Es wurde vorgeschlagen, dass vacuolar zytopathologie möglicherweise nicht dissociable von der Verbesserung der Aussehen der Haut, ist schnell hergestellt von topisch verabreicht, DMAE und könnte die zelluläre Grundlage des antiwrinkle Wirkung von DMAE . Aus unseren Ergebnissen geht hervor, dass die Vakuolisierung des Hautfibroblasten sowohl bei 0,1% als auch bei 0,2% der mit DMAE behandelten alternden Haut auftreten kann, was zu einer Zellschwellung und einer erhöhten Kollagenfaserdichte führt. Epithelzellen alternder Haut könnten auch auf die höhere Konzentration von 0,2% DMAE durch Vakuolisierung reagieren, die sich als erhöhte Epidermisdicke darstellte., Diese benötigen jedoch möglicherweise weitere Studien, um diese Angelegenheit zu klären.

Darüber hinaus zeigte die Messung des Hautwassergehalts keine Unterschiede zwischen allen behandelten Ratten, was darauf hindeutet, dass DMAE und Verbindung AA begrenzte Auswirkungen auf die Hautfeuchtigkeit hatten. Dies kann auf ein niedrigeres Konzentrationsniveau und eine kürzere Wirkdauer lokaler verfügbarer DMAE in der epidermalen Schicht zurückzuführen sein, wenn eine direkte subkutane Injektion zur DMAE-Abgabe verwendet wurde, was sich von der topischen Anwendung von DMAE unterscheidet.

5., Schlussfolgerungen

Mit dem durch D-Galactose induzierten Alterungsmodell der Ratte hat die Mesotherapie durch direkte Abgabe von DMAE und AA an das Zielgewebe eine ausgeprägte Anti-Aging-Wirkung, indem sie die Kollagensynthese und den Katabolismus fördert, um die Hautstruktur umzugestalten und die Dicke alternder Haut zu verbessern. Obwohl diese Experimente ein Rattenmodell verwendeten, sind die Ergebnisse für klinische Arbeiten relevant., Weitere Untersuchungen zum Verständnis des Wirkungsmechanismus von Dimethylaminoethanol und zusammengesetzter Aminosäure in alternder Haut werden bei der Entwicklung und dem Test leistungsfähigerer und wirksamerer Hautpflegeschemata zur weiteren Bewertung des Menschen helfen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass bezüglich der Veröffentlichung dieses Papiers kein Interessenkonflikt besteht.