Methoden für die Identifizierung koagulase-negativer Staphylokokken in
BIOCHEMIE CHARAKTERISIERUNG
Vergleich von Methoden zur Identifizierung von koagulase-negative Staphylokokken
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil
ABSTRACT
Koagulase-negative Staphylokokken (CNS) – Spezies-Identifizierung ist immer noch schwierig für die meisten klinischen Laboratorien., Das von Kloos und Schleifer vorgeschlagene und von Bannerman modifizierte Schema ist die Referenzmethode zur Identifizierung von Staphylokokkenarten und-unterarten; Diese Methode ist jedoch für den Routineeinsatz relativ mühsam, da sie die Verwendung einer großen Anzahl biochemischer Tests erfordert. Ziel der vorliegenden Studie war es, vier Methoden, d. H. Die Referenzmethode, das API-Staph-System (bioMérieux) und zwei Methoden, die von der Referenzmethode in unserem Labor modifiziert wurden (vereinfachte Methode und Disk-Methode), bei der Identifizierung von 100 ZNS-Stämmen zu vergleichen., Im Vergleich zur Referenzmethode identifizierten die vereinfachte Methode und die Scheibenmethode 100 bzw. 99% der ZNS-Arten korrekt, während diese Rate für das API-Staphsystem 84% betrug. Bei Staphylococcus epidermidis (2,2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37,5%) und S. warneri (47,1%) wurde eine ungenaue Identifizierung nach der API-Staphylokokken-Methode beobachtet., Die vereinfachte Methode unter Verwendung des in der vorliegenden Studie vorgeschlagenen einfachen Identifizierungsschemas erwies sich für alle getesteten Stämme als effizient, mit 100% Sensitivität und Spezifität und erwies sich als verfügbare Alternative zur Identifizierung von Staphylokokken, was eine höhere Zuverlässigkeit und geringere Kosten als die derzeit verfügbaren kommerziellen Systeme bietet. Diese Methode wäre sehr nützlich in der klinischen Mikrobiologie Labor, vor allem an Orten mit begrenzten Ressourcen.,
Schlüsselwörter: Koagulase-negative Staphylokokken-Methoden-Identifizierung-API Staph
Bisher wurden vierzig Arten der Gattung Staphylococcus identifiziert (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, eine Koagulase-positive Spezies, die eine Reihe anderer Enzyme und Toxine produziert, ist die bekannteste und wurde häufig an der Ätiologie einer Reihe von Infektionen und Intoxikationen bei Tieren und Menschen beteiligt, während Koagulase-negative Staphylokokken (ZNS), die die Mehrheit der Arten repräsentieren, als saprophytisch oder selten pathogen angesehen wurden (Kloos & Schleifer 1975)., In den letzten zehn Jahren wurde ZNS jedoch als ätiologische Erreger einer Reihe von infektiösen Prozessen anerkannt, die die am häufigsten aus Blutkulturen isolierten Mikroorganismen darstellen (Hübner & Goldmann 1999).
Etwa die Hälfte der ZNS-Arten besiedelt auf natürliche Weise den Menschen und gelten derzeit als im Wesentlichen opportunistische ätiologische Agenzien, die in zahlreichen organischen Situationen vorherrschen, um schwere Infektionen hervorzurufen (Bannerman 2003)., Das Auftreten von ZNS als Erreger verschiedener Infektionen kann das Ergebnis des zunehmenden Einsatzes invasiver Verfahren wie intravaskulärer Katheter und Prothesen bei Intensivpatienten, immungeschwächten Patienten, Frühgeborenen, Patienten mit Neoplasien und Transplantationspatienten sein (Kloos & Bannerman 1994).
Die Arten, die am häufigsten Krankheiten beim Menschen verursachen, sind S., epidermidis (Bakteriämie, Infektionen durch implantierte medizinische Geräte wie Prothesen und Katheter, Infektion von Operationswunden, Peritonitis bei Patienten mit kontinuierlicher Peritonealdialyse, Osteomyelitis, Endophthalmitis usw.), S. haemolyticus (Endokarditis, Peritonitis, Septikämie und Infektionen der Harnwege, Wunden, Knochen und Gelenke) und S. saprophyticus (Harnwegsinfektionen und septikämische Prozesse). Andere wichtige opportunistische Erreger gehören S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus und S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis scheint mit Endokarditis nach Implantation von Klappenprothesen, Peritonitis, Weichteilinfektion und vertebraler Osteomyelitis assoziiert zu sein (Osmon et al. 2000).
Angesichts des bekannten pathogenen Potenzials von ZNS im Krankenhausumfeld hat das Interesse an der Vielfalt der infektionsbezogenen Arten und ihrem toxigenen Potenzial und ihrer Virulenz im letzten Jahrzehnt zugenommen und zur Veröffentlichung verschiedener Studien zu diesen Aspekten geführt., Trotz der zunehmenden Charakterisierung von ZNS-Infektionen werden diese Mikroorganismen in klinischen mikrobiologischen Labors nicht identifiziert. Das von Kloos und Schleifer (1975) vorgeschlagene und von Bannerman (2003) modifizierte Schema ist das üblicherweise verwendete Verfahren; Dieses Verfahren ist jedoch für den Routineeinsatz relativ mühsam, da eine große Anzahl biochemischer Tests erforderlich ist., In den meisten Routinelabors werden Staphylokokken anhand morphologischer Aspekte der Kolonien, Gramfärbung und Katalase-und Koagulaseproduktion identifiziert, die nur die Klassifizierung von Staphylokokken in S. aureus-und Nicht-S. aureus-Isolate ermöglichen, wobei letztere einfach als ZNS klassifiziert werden.
Die Entwicklung von Methoden zur Identifizierung von Staphylokokkenarten und-unterarten ermöglicht es Klinikern, Informationen über die Vielfalt des in klinischen Proben vorhandenen ZNS zu erhalten und sie als ätiologische Erreger infektiöser Prozesse zu betrachten., Eine genaue Identifizierung des ZNS ist erforderlich, um eine frühzeitige Vorhersage der potenziellen Pathogenität oder Antibiotikaanfälligkeit jedes klinischen Isolats zu ermöglichen und die klinische Bedeutung jeder Spezies zu klären. Wiederholte ZNS-Isolate von Patienten mit invasiven Erkrankungen sollten identifiziert werden, um einen Vergleich der Stämme zu ermöglichen. Andererseits ist die Artenidentifikation eine Voraussetzung, bevor Typisierungsverfahren für epidemiologische Studien durchgeführt werden.,
Als Alternative zu den klassischen Identifikationsprotokollen wurden in den letzten Jahren mehrere kommerzielle Systeme zur schnellen Identifizierung von Staphylokokken entwickelt (Bannerman 2003). Diese Diagnosesysteme weisen jedoch Probleme wie Kosten und Inkubationszeit auf und liefern oft unzuverlässige Ergebnisse (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Darüber hinaus wurden viele dieser Kits für die Identifizierung aller bekannten ZNS-Arten (d. H. Klinische, veterinärmedizinische und ernährungsphysiologische Isolate) entwickelt und sind daher nicht sehr spezifisch., Auf der Grundlage der obigen Überlegungen und angesichts der Notwendigkeit schneller, einfacher und zuverlässiger Methoden bestand das Ziel der vorliegenden Studie darin, vier Techniken zur Identifizierung von ZNS zu vergleichen, d. H. Eine Referenzmethode (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), das kommerzielle API-Staphsystem und zwei Methoden, die aus der Referenzmethode in unserem Labor modifiziert wurden, um alternative Identifikationsmethoden zu entwickeln, die Einfachheit, Zuverlässigkeit und niedrige Kosten kombinieren, insbesondere für Orte mit begrenzten Ressourcen.,
MATERIALIEN UND METHODEN
Isolate – Einhundert ZNS-Isolate, die aus klinischen Proben von Patienten gewonnen wurden, die am Universitätsklinikum der Medizinischen Fakultät der Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu Campus, hospitalisiert wurden. Stämme wurden isoliert, wie von Koneman et al. (1997).
Identifizierung von ZNS-Die aus klinischen Proben erhaltenen Isolate wurden auf Blut-Agar plattiert und gram gefärbt, um ihre Reinheit und die Erhaltung ihrer Morphologie und spezifischen Färbung zu gewährleisten., Nach Bestätigung dieser Eigenschaften wurden die Isolate den Katalase-und Koagulase-Tests unterzogen. Staphylococcus wurde von Micrococcus-Arten auf der Grundlage der Oxidation und Fermentation von Glukose, der Resistenz gegen Bacitracin (0,04 U), die durch das Fehlen eines Hemmungshalos oder das Vorhandensein eines Hemmungshalos mit einem Durchmesser von bis zu 9 mm und der Anfälligkeit für Furazolidon (100 µg) gekennzeichnet ist, durch Hemmungszonen mit einem Durchmesser von 15 bis 35 mm (Baker 1984) unterschieden.
Die vier nachfolgend beschriebenen Methoden wurden zur Identifizierung von ZNS verwendet., Die folgenden internationalen Referenz ZNS-Stämme wurden als Kontrolle verwendet: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), und S. saprophyticus (ATCC 15305).,
Referenzmethode vorgeschlagen von Kloos und Schleifer (1975) und Bannerman (2003) – Diese Methode besteht aus einer Reihe von biochemischen Tests, die die Verwendung der Zucker bestimmen Xylose, Arabinose, Saccharose, Trehalose, Maltose, Mannitol, Lactose, Xylitol, Ribose, Fructose und Mannose, Produktion von Hämolysin, Nitratreduktion, Vorhandensein von Urease und Ornithindecarboxylase und Resistenz gegen Novobiocin, gekennzeichnet durch eine Hemmung Halo von bis Messwerte der Tests wurden nach 24, 48 und 72 h Inkubation bei 37ºC in einem Luft-Inkubator erhalten. ,
API Staph-Das API Staph System (bioMérieux) ist eine gebrauchsfertige Testbatterie, die aus 20 biochemischen Tests besteht, denen eine homogene Bakteriensuspension mit 0,5 McFarland Trübung zugesetzt wird. Nach 24 h Inkubation bei 37ºC und Zugabe der Reagenzien VP (VP1 und VP2), NIT (NIT1 und NIT2) und PAL (ZYM A und ZYM B), die das Kit begleiteten, wurden die Reaktionen interpretiert und Mikroorganismen anhand des Analysekatalogs identifiziert., Die Identifizierung basiert auf einem numerischen System, das aus sieben Ziffern besteht und eine prozentuale Identifizierung (%ID) bereitstellt, wobei der Wert > 80% akzeptabel ist.
Modifizierte Methoden-Es wurden zwei in unserem Labor modifizierte Identifikationsmethoden verwendet (vereinfachte Methode und Disk-Methode). Die vereinfachte Methode wurde in zwei Schritte unterteilt. Im ersten Schritt wurde die Fermentation von Xylose, Saccharose, Trehalose, Maltose und Mannitol, die Produktion von Hämolysin und das anaerobe Wachstum von Thioglykolat getestet (Tabelle I)., Die im zweiten Schritt verwendeten Tests variierten entsprechend den Ergebnissen, die im ersten Identifikationsschritt nach 72-h-Inkubation bei 37ºC erzielt wurden. Die ergänzenden Tests, die während des zweiten Schritts (falls erforderlich) verwendet werden, sind in Tabelle II angegeben.
Die zweite Methode bestand aus folgenden Tests: Fermentation von Arabinose, Saccharose, Trehalose, Maltose, Mannitol und Lactose, Nitratreduzierung, Produktion von Hämolysin, Tests auf Urease und Ornithindecarboxylase und Resistenz gegen Novobiocin., Für den Zuckerfermentationstest wurden handelsübliche Scheiben, die für jeden Zucker spezifisch waren, in Röhrchen mit 2,5 ml lila Brühe Basismedium gegeben. Bakterielle Suspensionen wurden wie von Kloos und Schleifer (1975) beschrieben geimpft. Die Messwerte für die beiden Methoden wurden nach 24, 48 und 72 h Inkubation bei 37 ° C erhalten, und ZNS-Arten wurden gemäß dem in der Abbildung vorgeschlagenen Identifikationsschema identifiziert.,
Statistische Analyse – Um den Grad der Übereinstimmung zwischen den Methoden zur Identifizierung von ZNS (vereinfachte Methode, Disk-Methode und API-Staph) und der Referenzmethode (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) zu bestimmen, wurden die Empfindlichkeit und Spezifität der Tests (Sox 1986) wie folgt bewertet.,
Empfindlichkeit: Anteil der ZNS-Stämme, die nach der Referenzmethode positiv auf eine bestimmte Art getestet wurden und die nach der analysierten Methode als dieselbe Art identifiziert wurden (vereinfachte Methode, Disk oder API Staph).
Spezifität: Anteil der ZNS-Stämme, die nach der Referenzmethode für eine bestimmte Art negativ getestet wurden und die bei der Untersuchung nach der analysierten Methode auch für dieselbe Art negativ waren (vereinfachte Methode, Disk oder API Staph).
ERGEBNISSE
Die 100 Staphylokokken-Isolate wurden mit den vier vorgeschlagenen Methoden getestet., Die mit der Referenzmethode erhaltenen Ergebnisse (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) wurden mit denen verglichen, die mit den modifizierten Methoden und dem API-Staphsystem erhalten wurden.
Tabelle III zeigt die Übereinstimmung in der Identifizierung zwischen den analysierten Assays und der Referenzmethode. Die vereinfachte Methode und die Disk-Methode zeigten 100 und 99% Positivität im Vergleich zur Referenzmethode, während dieser Prozentsatz für das API-Staph-System 84% betrug. Von den 16 Isolaten mit unterschiedlicher Identifizierung durch die API Staph-Methode, 10 (62.,5%) zeigten eine korrekte Identifizierung, jedoch mit einer % – ID von 7,1 bis 31%, die unter dem akzeptablen Wert lag.
Die in zwei Schritten durchgeführte vereinfachte Methode unterschied sich hinsichtlich der Identifizierung von ZNS-Arten nicht von der Referenzmethode. Im Gegensatz zu den anderen Methoden zeigte die Scheibenmethode eine ungenaue Identifizierung und identifizierte fälschlicherweise einen S. hominis-Stamm (6,5%) aufgrund der Nichtfermentation von Saccharose auf der Scheibe, was zur Klassifizierung dieses Stammes als S. caprae führte. Für die anderen Arten wurde keine Inkongruenz beobachtet.,
Die größte Diskrepanz wurde zwischen der Referenzmethode und dem API-Staph-System beobachtet, wobei die letztere Methode 1 S. epidermidis-Stamm (identifiziert als S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus-Stämme (2 identifiziert als S. aureus und 1 als S. hominis), 4 S. hominis-Stämme (2 identifiziert als S. lugdunensis, 1 als S. haemolyticus und 1 als S. aureus) und 8 S. warneri-Stamm (3 identifiziert als S. lugdunensis, 2 als S. hämolyticus, 2 als S. hominis und 1 als S. saprophyticus) (Tabelle III).,
DISKUSSION
ZNS sind die am häufigsten aus Blutkulturen isolierten Mikroorganismen, die in vielen Entwicklungsländern ein ernstes Gesundheitsproblem darstellen und ebenfalls entwickelt wurden (Renneberg et al. 1995). Einige Studien haben einen Zusammenhang zwischen S. epidermidis und nosokomialen Infektionen (Vuong & Otto 2002) vorgeschlagen, wobei diese Art bei 74 bis 92% der Patienten mit durch ZNS verursachten Bakteriemien identifiziert wurde (Martin et al. 1989). Andere Studien haben jedoch eine Reihe von Infektionen berichtet, die durch andere ZNS-Arten verursacht wurden (Herwaldt et al. 1996), vor allem S., haemolyticus, die am zweithäufigsten nachgewiesene Art (Bannerman 2003). Da ZNS die ätiologischen Erreger einer Reihe infektiöser Prozesse sind, ist die Identifizierung dieser Mikroorganismen wichtig für die Bestimmung ihrer physiopathologischen Eigenschaften und klinischen Bedeutung sowie für epidemiologische Studien und hat zur Veröffentlichung verschiedener Studien geführt, in denen Identifizierungsmethoden für diese Bakterien analysiert wurden (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, De Paulis et al. 2003).,
In der vorliegenden Studie erbrachten die in unserem Labor modifizierten Methoden gute Ergebnisse hinsichtlich der korrekten Klassifizierung von ZNS-Arten im Vergleich zur Referenzmethode, wobei 100% Zustimmung für die vereinfachte modifizierte Methode und 99% Zustimmung für die Disk-Methode beobachtet wurden.
Die vereinfachte Methode unter Verwendung der hier vorgeschlagenen Identifizierung sche-me (Abbildung) führte zur Identifizierung von S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis und S. simulans in einem einzigen Schritt unter Verwendung von insgesamt sieben biochemischen Tests, eine Zahl niedriger als die in der Referenzmethode verwendete (16 Tests)., Da S. epidermidis die am häufigsten isolierte Spezies ist, können 70 bis 90% der im klinischen Labor isolierten Stämme (Bannerman 2003) mit einer reduzierten Anzahl von Tests identifiziert werden.
In Bezug auf die Inkubationszeit zeigten die Ergebnisse, dass 91% der in der Studie analysierten Stämme den speziesspezifischen Zucker innerhalb von 48 h nach der Inkubation bei 37 ° C fermentierten., Die anderen Stämme (9%) wurden nach 72 h Inkubation positiv auf die Fermentation bestimmter Zucker getestet, was die Wichtigkeit einer Inkubation der Zuckerfermentationstests von mindestens 72 h demonstrierte, um diesen Mikroorganismus korrekt zu identifizieren.
Die Identifizierung der Unterarten S. cohnii, S. schleiferi schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus und S. lugdunensis erforderte die Durchführung von zwei oder drei zusätzlichen biochemischen Tests, die als zweiter Schritt bezeichnet wurden und entsprechend dem Ergebnis variierten, das im ersten Schritt der vereinfachten Methode erzielt wurde., Allerdings fermentierten 20 (37,7%) Stämme, die den zweiten Schritt für ihre Identifizierung benötigten, Trehalose innerhalb von 24 h, was eine vorherige Fortsetzung der zusätzlichen Tests ermöglichte. Zur Identifizierung der Unterarten S. cohnii, S. schleiferi schleiferi und S. caprae war eine längere Zeit erforderlich, da der zweite Schritt zur Identifizierung dieser Arten den Nitratreduktionstest umfasste, dessen Ergebnis erst nach 48 h verfügbar ist Diese Tatsache führt jedoch nicht zu einer Verzögerung der Diagnose von ZNS, da die Häufigkeit dieser Arten in klinischen Proben gering ist. ,
Die Disk-Methode erwies sich ebenfalls als sehr effizient und praktisch, da sie keine vorherige Zuckerzubereitung erfordert und somit den Verlust von Kulturmedien verhindert, zusätzlich zu einer hohen Übereinstimmung bei der Identifizierung von ZNS mit der Referenzmethode.
Das Commercial API Staph Kit zeigte die geringste Genauigkeit bei der Identifizierung von ZNS unter den untersuchten Methoden (84% Übereinstimmung), in Übereinstimmung mit den Studien von (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995).
S. warneri und S. hominis waren die am schwierigsten zu identifizierenden Arten. Bannerman et al., (1993) berichtete auch über eine geringere Genauigkeit bei der Identifizierung dieser Arten. In der Studie von Ieven et al. (1995), S. hominis wurde mit der geringsten Genauigkeit durch das API ID 32 Staph-System identifiziert. Dieser Befund könnte durch das Fehlen komplementärer Tests wie Novobiocinresistenz, anaerobes Wachstum der Thioglykolat-und Hämolysinproduktion erklärt werden.
Bei S., haemolyticus, eine falsche Identifizierung durch das API-Staph-System könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass das Kit keine Hämolysin-Produktion als komplementären Test vorschlägt, was für die Identifizierung von S. haemolyticus-Stämmen unerlässlich wäre.
Drei (3%) der 100 vom API-Staph-System analysierten Stämme wurden als S. aureus identifiziert, eine Tatsache, über die auch Renneberg et al. (1995). Das Kit erwies sich in diesen Fällen als ineffizient, da es nicht das Ergebnis des grundlegenden und am weitesten akzeptierten Tests zur Identifizierung von S. aureus, d. H., die koagulase-test (Koneman et al. 1997).
Nach Piccolomini et al. (1994) kann die geringe Übereinstimmung zwischen dem API-Staphylokokken und dem traditionellen biochemischen Test zur Identifizierung von ZNS durch die Verwendung unterschiedlicher Inkubationszeiten, Substratkonzentrationen und/oder Empfindlichkeitsmarkern erklärt werden.,
Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die beiden in unserem Labor modifizierten Methoden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zur Referenzmethode für den Routineeinsatz sehr effizient sind, zusätzlich zu weniger Tests und damit wirtschaftlicher und schneller als die Standardmethode. Trotz einer kürzeren Inkubationszeit (18 h) zeigte das API-Staph-System eine geringere Empfindlichkeit bei der Identifizierung einiger Arten., Zweifellos wird die Identifizierung von ZNS-Arten durch die Verfügbarkeit eines einfachen, kostengünstigen und genauen Verfahrens erleichtert und gefördert, insbesondere an Orten mit begrenzten Ressourcen.
DANKSAGUNGEN
An bioMérieux für die Spende der in der vorliegenden Studie verwendeten API-Staph-Kits.
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