Mikroskopauflösung: Konzepte, Faktoren und Berechnung
Unter Berücksichtigung aller oben genannten Theorien ist klar, dass bei der Berechnung der theoretischen Auflösungsgrenzen eine Reihe von Faktoren zu berücksichtigen sind. Die Auflösung hängt auch von der Art der Probe ab. Betrachten wir die Berechnung der Auflösung unter Verwendung der Beugungsgrenze von Abbe und auch unter Verwendung des Rayleigh-Kriteriums.,
Erstens sollte daran erinnert werden, dass:
NA= n x sin α
Wobei n der Brechungsindex des bildgebenden Mediums und α die Hälfte der Winkelöffnung des Objektivs ist. Die maximale Winkelöffnung eines Objektivs liegt bei 144º. Der Sinus der Hälfte dieses Winkels beträgt 0,95. Bei Verwendung eines Tauchobjektivs mit Öl mit einem Brechungsindex von 1,52 beträgt die maximale NA des Objektivs 1,45. Bei Verwendung eines „trockenen“ (Nicht Immersions -) Objektivs beträgt die maximale NA des Objektivs 0,95 (da Luft einen Brechungsindex von 1,0 hat).Abbe ‚ s Beugungsformel für laterale (z., XY) Auflösung ist:
d= λ / 2 NA
Wobei λ die Wellenlänge des Lichts ist, das zum Abbilden einer Probe verwendet wird. Bei Verwendung eines grünen Lichts von 514 nm und eines Öltauchobjektivs mit einer NA von 1,45 beträgt die (theoretische) Auflösungsgrenze 177 nm.
Die Beugungsformel von Abbe für die axiale (dh Z) Auflösung lautet:
d= 2 λ/NA2
Wenn wir wiederum eine Wellenlänge von 514 nm annehmen, um eine Probe mit einem Ziel von NA-Wert von 1,45 zu beobachten, beträgt die axiale Auflösung 488 nm.
Das Rayleigh-Kriterium ist eine leicht verfeinerte Formel, die auf den Beugungsgrenzen von Abbe basiert:
R= 1.,22 λ / NAobj+NAcond
Wobei λ die Wellenlänge des Lichts ist, das zum Abbilden einer Probe verwendet wird. NAobj ist die NA des Ziels. NAcond ist die NA des Kondensators. Die Zahl von ‚1.22‘ ist eine Konstante. Dies ist abgeleitet von Rayleighs Arbeit an Bessel-Funktionen. Diese werden zur Berechnung von Problemen in Systemen wie der Wellenausbreitung verwendet.
Unter Berücksichtigung der NA des Kondensators ist Luft (mit einem Brechungsindex von 1,0) im Allgemeinen das bildgebende Medium zwischen Kondensator und Objektträger. Angenommen, der Kondensator hat eine Winkelöffnung von 144º, entspricht der NAcond-Wert 0,95.,
Bei Verwendung eines grünen Lichts von 514 nm, eines Ölaustauchobjektivs mit einem NA von 1,45 und eines Kondensators mit einem NA von 0,95 beträgt die (theoretische) Auflösungsgrenze 261 nm.
Je kürzer die Wellenlänge des Lichts ist, die zum Abbilden einer Probe verwendet wird, desto mehr Details werden aufgelöst. Wenn also die kürzeste sichtbare Lichtwellenlänge von 400 nm mit einem Öltauchobjektiv mit einem NA von 1,45 und einem Kondensator mit einem NA von 0,95 verwendet wird, würde R 203 nm entsprechen.,
Um die maximale (theoretische) Auflösung in einem Mikroskopsystem zu erreichen, sollte jede der optischen Komponenten die höchste verfügbare Auflösung aufweisen (unter Berücksichtigung der Winkelöffnung). Darüber hinaus erhöht die Verwendung einer kürzeren Lichtwellenlänge zum Betrachten der Probe die Auflösung. Schließlich sollte das gesamte Mikroskopsystem korrekt ausgerichtet sein.