Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer
Abbildung 1. Hämozytometer Gitterlinien.
Hämozytometerdiagramm, das einen der Sätze von 16 Quadraten angibt, die zum Zählen verwendet werden sollten.
Webinar-Transkript
Das Zählen von Zellen ermöglicht die genaue Bestimmung von Zellzahlen und damit die Konsistenz zwischen Experimenten. In diesem Video wird das Verfahren zum Zählen von Suspensions-und Adhäsionszellen mit einem Hämozytometer beschrieben.
Vor Arbeitsbeginn das Innere des Laminar Flow Safety Cabinet gründlich mit Desinfektionsmittel besprühen und mit einem Tuch abwischen., Entsorgen Sie gebrauchtes Gewebe im entsprechenden Abfallbehälter. Sprühen Sie anschließend die Innenseite der Haube mit 70% Ethanol ein und wischen Sie sie mit einem Tuch ab. Die Haube ist jetzt sauber und einsatzbereit. Entfernen Sie Zellkulturmedien und Trypsin aus dem Kühlschrank und legen Sie es in einen befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator mit 37 Grad C zum Erwärmen. Betrachten Sie in der Zwischenzeit die zu zählenden Zellen mit einem Mikroskop, um auf visuelle Anzeichen einer bakteriellen und pilzlichen Kontamination zu überprüfen. Sprühen Sie Medienflaschen und Pipetten mit 70% Ethanol, bevor Sie im Laminar Flow Safety Cabinet spielen.,
Bei Suspensionszellen den Kolben vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass die Zellen gut gemischt sind. Bevor sie sich absetzen können, nehmen Sie eine 0, 5-Milliliter-Probe Zellsuspension und pipettieren sie in ein steriles Eppendorf-Röhrchen. Entfernen Sie vorhandene Medien, waschen Sie sie mit PBS bei Raumtemperatur und fügen Sie Trypsin EDTA hinzu, um die Zellen zu lösen. Die erforderlichen Mengen an PBS und Trypsin finden Sie in Tabelle 1. Inkubieren Sie die Zellen für zwei bis fünf Minuten in dem befeuchteten 37 Grad C, Kohlendioxid-Inkubator. Die Inkubationszeit muss für den Zelltyp optimiert werden., Wenn alle Zellen abgelöst sind, neutralisieren Sie das Trypsin EDTA mit warmem Serum, das Wachstumsmedien enthält, die für die Zellen und die Kultur geeignet sind. Die erforderlichen Volumes finden Sie in Tabelle 1.
Setzen Sie die Zellen erneut auf, indem Sie die Zellsuspension dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren und in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 1.000 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur., Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen serologischen Pipette und suspendieren Sie die Zellpalette mit 37-Grad-C-Serum, das Wachstumsmedien enthält, wieder auf das ursprüngliche Volumen der Startkultur. Nehmen Sie mit einer sterilen Fünf-Milliliter-Pipette eine 0,5-Milliliter-Probe der Zellsuspension und überführen Sie sie in ein steriles Eppendorf-Röhrchen.
Um zu zählen, bereiten Sie das Einweg-Hämozytometer vor. Mit einer P2000 Gilson Pipette, nehmen Sie 100 Mikroliter suspension, und fügen Sie 400 Mikroliter trypan blau, hinweis, .08% und gut mischen., Nehmen Sie 100 Mikroliter der Trypan Blue Cell Suspensionsmischung und pipettieren Sie vorsichtig einen Tropfen der Suspension in den Brunnen der Zählkammer, so dass die Probe kapillarartig eingezogen werden kann. Achten Sie darauf, die Zählkammer nicht zu überfüllen. Betrachten Sie den Zählbereich unter einer 10-fachen Vergrößerung mit einem umgekehrten Mikroskop. Konzentrieren Sie sich mit dem Mikroskop auf eines der vier mal vier Gitter auf dem Hämozytometer und zählen Sie die Zellen negativ für Trypanblau. Diese sind lebensfähig. Notieren Sie sich auch, wie viele Zellen für Trypan Blue positiv waren., Diese Zellen sind tot, und diese Zahl kann später verwendet werden, um die prozentuale Lebensfähigkeit der Kultur bei Bedarf zu berechnen.
Verwenden Sie beim Zählen ein System, bei dem Zellen nur gezählt werden, wenn sie sich innerhalb eines Quadrats oder auf der rechten oder unteren Randlinie befinden. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die in diesem Satz von 16 Quadraten gezählt wurden, und bewegen Sie das Hämozytometer, bis alle vier Sätze von 16 Quadraten auf dem Hämozytometer gezählt und ihre Werte aufgezeichnet wurden., Um die Zellkonzentration zu berechnen, nehmen Sie die durchschnittliche Anzahl lebensfähiger Zellen in den vier Sätzen von 16 Quadraten und multiplizieren Sie mit 10.000, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu erhalten. Multiplizieren Sie dies dann mit fünf, um die eine von fünf Verdünnungen aus der Trypan Blue-Zugabe zu korrigieren. Dieser Endwert ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter in der ursprünglichen Zellsuspension.,
Wenn Ihre lebensfähige Zellzahl beispielsweise 200.000 Zellen pro Milliliter in einem Volumen von 20 Millilitern beträgt und Sie 10.000 Zellen in den neuen Kolben sehen möchten, müssen Sie 50 Mikroliter Ihrer Zellsuspension in den neuen Kolben übertragen. Übertragen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in den neuen Kolben. Mit Medien auffüllen und in den Inkubator geben.