de métodos para la identificación de estafilococos coagulasa negativos
caracterización bioquímica
comparación de métodos para la identificación de estafilococos coagulasa negativos
Maria De Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil
resumen
la identificación de especies de estafilococos coagulasa negativos (SNC) sigue siendo difícil para la mayoría de los Laboratorios Clínicos., El esquema propuesto por Kloos y Schleifer y modificado por Bannerman es el método de referencia utilizado para la identificación de especies y subespecies estafilocócicas; sin embargo, este método es relativamente laborioso para el uso rutinario ya que requiere la utilización de un gran número de pruebas bioquímicas. El objetivo del presente estudio fue comparar cuatro métodos, es decir, el método de referencia, el sistema de estafilococos API (bioMérieux) y dos métodos modificados del método de referencia en nuestro laboratorio (método simplificado y método de disco), en la identificación de 100 cepas del SNC., En comparación con el método de referencia, el método simplificado y el método de disco identificaron correctamente el 100 y el 99% de las especies del SNC, respectivamente, mientras que esta tasa fue del 84% para el sistema de estafilococos API. Se observó una identificación inexacta por el método API Staphylococcus epidermidis (2,2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37,5%) y S. warneri (47,1%)., El método simplificado utilizando el esquema de identificación simple propuesto en el presente estudio fue encontrado eficiente para todas las cepas probadas, con sensibilidad y especificidad del 100% y demostró ser una alternativa disponible para la identificación de estafilococos, ofreciendo mayor confiabilidad y menor costo que los sistemas comerciales actualmente disponibles. Este método sería muy útil en laboratorio de microbiología clínica, especialmente en lugares con recursos limitados.,
Palabras Clave: estafilococos coagulasa-negativos – métodos – identificación – API Staph
cuarenta especies del género Staphylococcus han sido identificadas hasta ahora (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, spergser et al. 2003). S., aureus, una especie coagulasa positiva que produce una serie de otras enzimas y toxinas, es la más conocida y ha sido frecuentemente implicada en la etiología de una serie de infecciones e intoxicaciones en animales y humanos, mientras que los estafilococos coagulasa negativos (SNC), que representan la mayoría de las especies, han sido considerados saprofíticos o raramente patógenos (Kloos & Schleifer 1975)., En la última década, sin embargo, los NAFTALENOS clorados han sido reconocidos como agentes etiológicos de una serie de procesos infecciosos, representando los microorganismos más comúnmente aislados de hemocultivos (Huebner & Goldmann 1999).
aproximadamente la mitad de las especies de NAFTALENOS clorados colonizan naturalmente a los seres humanos, y en la actualidad se consideran agentes etiológicos esencialmente oportunistas, que prevalecen en numerosas situaciones orgánicas para producir infecciones graves (Bannerman 2003)., La aparición de SNC como patógenos de diferentes infecciones puede ser el resultado del uso creciente de procedimientos invasivos como catéteres intravasculares y prótesis en pacientes sometidos a tratamiento intensivo, pacientes inmunocomprometidos, niños prematuros, pacientes con neoplasias y pacientes trasplantados (Kloos & Bannerman 1994).
Las especies que más frecuentemente causan enfermedades en humanos son S., epidermidis (bacteriemia, infecciones debidas a dispositivos médicos implantados como prótesis y catéteres, infección de heridas quirúrgicas, peritonitis en pacientes en diálisis peritoneal continua, osteomielitis, endoftalmitis etc.), S. haemolyticus (endocarditis, peritonitis, septicemia, infecciones del tracto urinario, heridas, huesos y articulaciones), y S. saprophyticus (infecciones urinarias y septicémica procesos). Otros patógenos oportunistas significativos incluyen S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus, y S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis parece estar asociado con endocarditis tras implantación de prótesis valvulares, con peritonitis, con infección de tejidos blandos y con osteomielitis vertebral (Osmon et al. 2000).
en vista del potencial patógeno conocido del SNC en el ambiente hospitalario, el interés por la variedad de especies relacionadas con la infección y su potencial toxígeno y virulencia ha aumentado en la última década y ha llevado a la publicación de diversos estudios sobre estos aspectos., Sin embargo, a pesar de la creciente caracterización de las infecciones del SNC, estos microorganismos no se identifican en los laboratorios de Microbiología Clínica. El esquema propuesto por Kloos y Schleifer (1975) y modificado por Bannerman (2003) es el método convencionalmente utilizado; sin embargo, este método es relativamente laborioso para el uso rutinario ya que se requiere un gran número de pruebas bioquímicas., En la mayoría de los laboratorios de rutina, los estafilococos son identificados con base en aspectos morfológicos de las colonias, tinción de gram y producción de catalasa y coagulasa, lo que solo permite la clasificación de estafilococos en aislados de S. aureus y no S. aureus, siendo este último simplemente Clasificado como SNC.
el desarrollo de métodos para la identificación de especies y subespecies estafilocócicas permite a los médicos obtener información sobre la variedad de SNC presentes en especímenes clínicos y considerarlos como agentes etiológicos de procesos infecciosos., Es necesaria una identificación precisa de los NAFTALENOS clorados para poder predecir con prontitud la patogenicidad potencial o la susceptibilidad a los antibióticos de cada aislado clínico y aclarar la importancia clínica de cada especie. Se deben identificar aislados repetidos del SNC de pacientes con enfermedades invasivas para permitir una comparación de las cepas. Por otro lado, la identificación de especies es un requisito previo antes de que se emprendan procedimientos de tipificación para estudios epidemiológicos.,
en los últimos años, se han desarrollado varios sistemas comerciales para la identificación rápida de estafilococos como una alternativa a los protocolos de identificación clásicos (Bannerman 2003). Sin embargo, estos sistemas de diagnóstico presentan problemas como el costo y el tiempo de incubación, a menudo proporcionan resultados poco fiables (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Además, muchos de estos kits se diseñaron para la identificación de todas las especies conocidas de NAFTALENOS clorados (es decir, aislados clínicos, veterinarios y alimentarios) y, por lo tanto, no son muy específicos., Con base en las consideraciones anteriores y en vista de la necesidad de métodos rápidos, simples y confiables, el objetivo del presente estudio fue comparar cuatro técnicas para la identificación de los NAFTALENOS clorados, es decir, un método de referencia (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), el sistema comercial API Staph, y dos métodos modificados del método de referencia en nuestro laboratorio para desarrollar métodos de identificación alternativos que combinan simplicidad, confiabilidad y bajo costo, especialmente para lugares con recursos limitados.,
materiales y métodos
aislados – se estudiaron cien aislados del SNC obtenidos de muestras clínicas de pacientes hospitalizados en el Hospital Universitario de la Facultad de Medicina de la Universidad Estadual Paulista (Unesp), Campus de Botucatu. Las cepas se aislaron según lo descrito por Koneman et al. (1997).
Identificación del SNC – los aislados obtenidos de muestras clínicas fueron plateados sobre agar sanguíneo y teñidos de gramo para garantizar su pureza y la preservación de su morfología y tinción específica., Tras la confirmación de estas características, los aislados fueron sometidos a las pruebas de catalasa y coagulasa. Staphylococcus se diferenció de las especies de Micrococcus sobre la base de la oxidación y fermentación de la glucosa, la resistencia a la bacitracina (0.04 U) indicada por la ausencia de un halo de inhibición o la presencia de un halo de inhibición de hasta 9 mm de diámetro, y la susceptibilidad a la furazolidona (100 µg) caracterizada por zonas de inhibición de 15 a 35 mm de diámetro (Baker 1984).
para la identificación de los NAFTALENOS clorados se utilizaron los cuatro métodos que se describen a continuación., Se utilizaron como controles las siguientes cepas internacionales de referencia del SNC: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979) y S. saprophyticus (ATCC 15305).,
método de referencia propuesto por Kloos y Schleifer (1975) y Bannerman (2003) – este método consiste en un conjunto de pruebas bioquímicas que determinan la utilización de los azúcares xilosa, arabinosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, manitol, lactosa, xilitol, ribosa, fructosa y manosa, producción de hemolisina, reducción de nitratos, presencia de ureasa y ornitina descarboxilasa, y resistencia a novobiocina caracterizada por se obtuvo un halo de inhibición de hasta 16 mm. las lecturas de las pruebas se obtuvieron después de 24, 48 y 72 h de incubación a 37ºC en una incubadora de aire. ,
API Staph-el sistema API Staph (bioMérieux) es una batería de prueba lista para usar que consta de 20 pruebas bioquímicas a las que se agrega una suspensión bacteriana homogénea a 0.5 McFarland turbidez. Tras 24 h de incubación a 37ºC y la adición de los reactivos VP (VP1 y VP2), NIT (NIT1 y NIT2) y PAL (ZYM A y ZYM B) que acompañaban al kit, se interpretaron las reacciones y se identificaron los microorganismos mediante el catálogo analítico., La identificación se basa en un sistema numérico que consta de siete dígitos que proporciona una identificación porcentual (%ID), siendo aceptable un valor > 80%.
métodos modificados-se utilizaron dos métodos de identificación modificados en nuestro laboratorio (método simplificado y método de disco). El método simplificado se dividió en dos etapas. Durante el primer paso, se probó la fermentación de xilosa, sacarosa, trehalosa, maltosa y manitol, la producción de hemolisina y el crecimiento anaeróbico en tioglicolato (Tabla I)., Las pruebas utilizadas en el segundo paso variaron de acuerdo con los resultados obtenidos en el primer paso de identificación después de la incubación de 72 h a 37ºC. Las pruebas complementarias utilizadas durante el segundo paso (cuando sea necesario) se especifican en la Tabla II.
el método de disco consistió en las siguientes pruebas: fermentación de arabinosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, manitol y lactosa, reducción de nitratos, producción de hemolisina, pruebas de ureasa y ornitina descarboxilasa y resistencia a novobiocina., Para la prueba de fermentación del azúcar, los discos disponibles comercialmente específicos para cada azúcar se colocaron en tubos que contenían 2,5 ml de Medio base de caldo morado. Las suspensiones bacterianas fueron inoculadas según lo descrito por Kloos y Schleifer (1975). Las lecturas de los dos métodos se obtuvieron después de 24, 48 y 72 h de incubación a 37ºC, y se identificaron especies de NAFTALENOS clorados de acuerdo con el esquema de identificación propuesto en la figura.,
análisis estadístico – para determinar el grado de acuerdo entre los métodos utilizados para la identificación de CNS (método simplificado, método de disco y API Staph) y el método de referencia (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), la sensibilidad y especificidad de las pruebas (Sox 1986) se evaluaron de la siguiente manera.,
sensibilidad: proporción de cepas del SNC que dieron positivo para una determinada especie por el método de referencia y que fueron identificadas como la misma especie por el método analizado (método simplificado, Disk o API Staph).
especificidad: proporción de cepas del SNC que resultaron negativas para una especie determinada por el método de referencia y que también fueron negativas para la misma especie cuando se probaron por el método analizado (método simplificado, Disk o API Staph).
resultados
los 100 aislados estafilocócicos fueron probados por los cuatro métodos propuestos., Los resultados obtenidos con el método de referencia (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) se compararon con los obtenidos con los métodos modificados y el sistema API Staph.
La Tabla III muestra la concordancia en la identificación entre los ensayos analizados y el método de referencia. El método simplificado y el método de disco mostraron una positividad de 100 y 99% en comparación con el método de referencia, mientras que este porcentaje fue de 84% para el sistema API Staph. De los 16 aislados con desacuerdo de identificación por el método API Staph, 10 (62.,5%) mostraron una identificación correcta pero con un % ID de 7,1 a 31%, inferior al valor aceptable.
el método simplificado realizado en dos etapas no difirió del método de referencia en lo que respecta a la identificación de especies de NAFTALENOS clorados. En contraste con los otros métodos, el método de disco mostró una identificación inexacta e identificó erróneamente una cepa de S. hominis (6.5%) debido a la no fermentación de sacarosa en el disco, lo que llevó a la clasificación de esta cepa como S. caprae. No se observó incongruencia para las otras especies.,
la mayor discrepancia se observó entre el método de referencia y el sistema API Staph, con este último método no identificando con precisión 1 cepa de S. epidermidis (identificada como S. lugdunensis), 3 cepas de S. haemolyticus (2 identificadas como S. aureus y 1 Como S. hominis), 4 cepas de S. hominis (2 identificadas como S. lugdunensis, 1 Como S. haemolyticus y 1 Como S. aureus), y 8 cepas de S. warneri (3 identificadas como S. lugdunensis, 2 Como S. haemolyticus, 2 Como S. hominis y 1 Como S. saprophyticus) (tabla III).,
discusión
Los NAFTALENOS clorados son los microorganismos más comúnmente aislados de hemocultivos, lo que representa un grave problema de salud en muchos países en desarrollo y también desarrollados (Renneberg et al. 1995). Algunos estudios han sugerido una asociación entre S. epidermidis e infecciones nosocomiales (Vuong & Otto 2002) con esta especie siendo identificada en 74 a 92% de pacientes con bacteremias causadas por SNC (Martin et al. 1989). Sin embargo, otros estudios han reportado una serie de infecciones causadas por otras especies del SNC (Herwaldt et al. 1996), principalmente S., haemolyticus, que es la segunda especie más frecuentemente detectada (Bannerman 2003). Dado que los NAFTALENOS clorados son los agentes etiológicos de una serie de procesos infecciosos, la identificación de estos microorganismos es importante para la determinación de sus características fisiopatológicas e importancia clínica y para estudios epidemiológicos, y ha llevado a la publicación de varios estudios que analizan los métodos de identificación de estas bacterias (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, de Paulis et al. 2003).,
en el presente estudio, los métodos modificados en nuestro laboratorio arrojaron buenos resultados en cuanto a la correcta clasificación de las especies del SNC en comparación con el método de referencia, observándose un 100% de acuerdo para el método simplificado modificado y un 99% de acuerdo para el método de disco.
el método simplificado utilizando la identificación sche-me propuesta aquí (Figura) condujo a la identificación de S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis y S. simulans en un solo paso, utilizando un total de siete pruebas bioquímicas, un número inferior al empleado en el método de referencia (16 pruebas)., Dado que S. epidermidis es la especie aislada con más frecuencia, del 70 al 90% de las cepas (Bannerman 2003) aisladas en el laboratorio clínico se pueden identificar utilizando un número reducido de pruebas.
con respecto al tiempo de incubación, los resultados mostraron que el 91% de las cepas analizadas en el estudio fermentaron el azúcar específico de la especie dentro de las 48 h de incubación a 37ºC., Las otras cepas (9%) dieron positivo para la fermentación de azúcares dados después de 72 h de incubación, lo que demuestra la importancia de una incubación de las pruebas de fermentación de azúcar de al menos 72 h para identificar correctamente estos microorganismos.
la identificación de las subespecies de S. cohnii, S. schleiferi schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. Haemolyticus, S. saprophyticus y S. lugdunensis requirió la ejecución de dos o tres pruebas bioquímicas adicionales, denominadas segundo paso, que variaron de acuerdo con el resultado obtenido en el primer paso del método simplificado., Sin embargo, 20 (37,7%) cepas que requirieron el segundo paso para su identificación fermentaron trehalosa en 24 h, permitiendo así la continuación previa de las pruebas adicionales. Se necesitó más tiempo para identificar a S. cohnii, S. schleiferi subespecie schleiferi, y S. caprae, ya que el segundo paso requerido para la identificación de estas especies incluyó la prueba de reducción de nitratos cuyo resultado solo está disponible después de 48 h. sin embargo, este hecho en realidad no resulta en un retraso en el diagnóstico de SNC ya que la frecuencia de estas especies en muestras clínicas es baja.,
el método de disco también se encontró altamente eficiente y práctico ya que no requiere preparación previa de azúcares, evitando así la pérdida de medios de cultivo, además de alcanzar un alto acuerdo en la identificación de los NAFTALENOS clorados con el método de referencia.
El kit de estafilococos API comercial mostró la menor precisión en la identificación de SNC entre los métodos estudiados (84% de acuerdo), en concordancia con los estudios de (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995).
S. warneri y S. hominis fueron las especies más difíciles de identificar. Bannerman et al., (1993) también reportaron una menor precisión en la identificación de estas especies. En el estudio de Ieven et al. (1995), S. hominis fue identificado con la menor precisión por el API ID 32 Staph system. Este hallazgo podría explicarse por la falta de pruebas complementarias como la resistencia a la novobiocina, el crecimiento anaeróbico en tioglicolato y la producción de hemolisina.
En el caso de S., haemolyticus, identificación incorrecta por el sistema API Staph podría explicarse por el hecho de que el kit no sugiere la producción de hemolisina como una prueba complementaria, que sería esencial para la identificación de las cepas de S. haemolyticus.
tres (3%) de las 100 cepas analizadas por el sistema API Staph fueron identificadas como S. aureus, un hecho también reportado por Renneberg et al. (1995). Se encontró que el kit era ineficiente en estos casos, ya que no solicitaba el resultado de la prueba fundamental y más ampliamente aceptada para la identificación de S. aureus, i. e.,, la prueba de la coagulasa (Koneman et al. 1997).
según Piccolomini et al. (1994), la baja concordancia entre el estafilococo API y la prueba bioquímica tradicional para la identificación de los NAFTALENOS clorados puede explicarse por el uso de diferentes tiempos de incubación, concentraciones de sustrato y/o marcadores de sensibilidad.,
en conclusión, se encontró que los dos métodos modificados en nuestro laboratorio son altamente eficientes para el uso rutinario debido a su alta sensibilidad y especificidad en comparación con el método de referencia, además de requerir menos pruebas y por lo tanto ser más económico y más rápido que el método estándar. A pesar de requerir un tiempo de incubación más corto (18 h), el sistema de estafilococos API mostró una menor sensibilidad en la identificación de algunas especies., Sin lugar a dudas, la identificación de especies de NAFTALENOS clorados será más fácil y alentada por la disponibilidad de un procedimiento sencillo, económico y preciso, especialmente en lugares con recursos limitados.
agradecimientos
a bioMérieux por la donación de los kits de estafilococos API utilizados en el presente estudio.
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