efectos del dimetilaminoetanol y el aminoácido compuesto en el modelo de envejecimiento cutáneo inducido por D-galactosa de rata
resumen
un sueño duradero de los seres humanos es revertir o posponer el envejecimiento. En este estudio, se investigaron el dimetilaminoetanol (DMAE) y el aminoácido compuesto (AA) EN mesoterapia por sus posibles efectos antienvejecimiento en la piel inducida por la D-galactosa. A los 18 días de la inducción de D-gal, cada rata fue tratada con microinyección intradérmica de solución salina, AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA, o 0,2% DMAE + AA, respectivamente., A los 42 días después del tratamiento, la herida de la piel fue cosechada y analizada. La medición del espesor epidérmico y dérmico en los grupos de 0,1% DMAE + AA y 0,2% DMAE + AA apareció significativamente más gruesa que las ratas control de envejecimiento. No se encontraron diferencias en el contenido de agua tisular entre los grupos. La hidroxiprolina en los grupos 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA y control simulado fue mucho mayor que en todos los demás grupos. La expresión de colágeno tipo I, tipo III y MMP-1 fue altamente regulada en los grupos de 0,1% DMAE + AA y 0,2% DMAE + AA en comparación con el control del envejecimiento., En contraste, los niveles de expresión de TIMP-1 de varios grupos de envejecimiento se redujeron significativamente en comparación con el control simulado. La coinyección de DMAE y AA en el tejido diana tiene efectos antienvejecimiento marcados en el modelo de envejecimiento cutáneo inducido por D-galactosa de rata.
1. Introducción
el Antiaging es un tema eterno y sueño del ser humano., Los cambios cutáneos relacionados con la edad son inevitables e incluyen adelgazamiento, flacidez, arrugas, pérdida de elasticidad, áreas de sequedad y un recambio inverso de la relación de colágeno tipo I/III en la piel que se presentó como síntesis reducida de colágeno tipo I pero producción de colágeno tipo III mejorada . Actualmente la mesoterapia ha estado despertando el interés de todos como una estrategia antiaging., Es un procedimiento mínimamente invasivo, que consiste en la microinyección intradérmica de sustancias farmacológicas, como nutrientes, hormonas, vitaminas, enzimas y otros reactivos, que se han diluido y se administran directamente en la región a tratar. Bajo manipulación estéril y profesional, la mesoterapia rara vez causa problemas de infección de la piel y necrosis, excepto algunos riesgos menores como hinchazón y dolor durante la inyección., Como un procedimiento seguro, simple y menos doloroso, que es uno de los llamados» procedimientos cosméticos a la hora del almuerzo», no requiere tiempo de recuperación y es perfecto para profesionales y personas exitosas en la vida moderna de ritmo rápido .
dimetilaminoetanol (DMAE), un análogo de la vitamina B colina y un precursor de la acetilcolina, ha estado recibiendo más atención como un nuevo y emocionante suplemento para el cuidado de la piel hoy en día por sus efectos agudos de antienvejecimiento, antiarrugas y firmeza de la piel. DMAE es bien conocido por su uso en aplicaciones externas., En los estudios clínicos aleatorizados, el gel facial DMAE al 3% ha demostrado ser Seguro y eficaz en la mitigación de las líneas de la frente y las arrugas finas periorbitales, y en la mejora de la plenitud y la forma de los labios y la apariencia general de la piel facial . Una extensión abierta del ensayo también mostró que la aplicación a largo plazo del gel DMAE durante un máximo de 1 año se asoció con un buen perfil de seguridad ., Sin embargo, el tratamiento tropical con DMAE generalmente requiere dosis y concentración altas para pasar a través de la barrera de permeabilidad epidérmica, lo que podría incurrir en preocupaciones por su toxicidad, efectos secundarios y costos médicos. Se reportó que 2.5-10 mmol/mL DMAE podría causar una Citopatología vacuolar de células de fibroblastos humanos cultivadas in vitro. Además, los estudios mostraron que la aplicación de gel DMAE al 3% en el trópico también podría incurrir en la Citopatología vacuolar de las células epidérmicas del oído de conejo. La administración alternativa de DMAE es necesaria para evaluar la eficacia relativa para la mejora de la piel envejecida.,
con el fin de evaluar los posibles efectos antienvejecimiento de la DMAE en dosis bajas administrada intradérmicamente por microinyección localizada (mesoterapia), se midió en este estudio la estructura tisular y el metabolismo del colágeno de la piel envejecida inducida por D-gal. Mientras tanto, la coinyección del aminoácido compuesto (AA), que conduce a una toxicidad celular reducida por la inyección de DMAE y a ser un suministro de nutrición local, también se estudió. También se describió su considerado mecanismo de acción en la piel.
2. Materiales y Métodos
2.1., Animales
Las ratas Wistar macho se compraron en el Instituto de Ciencias Farmacéuticas (Qingdao, China). Todos los animales pesaban 180-220 g en el momento de la cirugía. El cuidado de los animales y el protocolo experimental fueron aprobados por el hospital afiliado De La Facultad de Medicina de la Universidad de Qingdao.
Un total de 80 ratas Wistar se dividieron aleatoriamente en cada grupo experimental (como se detalla en la tabla 1)., A los animales de cada grupo de Tratamiento, excepto al grupo de control simulado, se les administró una inyección subcutánea de D-galactosa (D-gal) a la dosis de 125 mg/kg·d durante 6 semanas para inducir el modelo de envejecimiento cutáneo de rata. A los 18 días de la inyección de D-gal, cada rata fue anestesiada con hidrato de cloral (0,25 mL por 100 g de peso corporal) y desinfectada dentro de la zona de la cadera. Se prefabricó un área de tatuaje redonda de 3 cm a cada lado de la cadera de la rata y luego se trató con anestesia general una vez por semana durante 4 semanas con microinyección intradérmica de solución salina (NS), AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA, o 0.,2% DMAE + AA, respectivamente. Tanto el grupo de control negativo del envejecimiento como el grupo de control simulado recibieron exactamente el mismo procedimiento quirúrgico pero sin ningún tratamiento en estudio. A los 42 días después del tratamiento, todos los animales fueron sacrificados y las heridas cutáneas se compararon por histología, medición del contenido de agua, contenido de hidroxiprolina y pruebas cuantitativas de PCR en tiempo real.
2.2. Histopatología
el grosor de la piel se midió con el software SimplePCI Image analysis (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) en secciones teñidas con hematoxilina y eosina., El espesor epidérmico se midió desde la superficie del estrato córneo (SC) hasta el fondo de las papilas dérmicas, mientras que el espesor dérmico se midió desde la parte superior de las papilas hasta las porciones más profundas de la dermis reticular hasta que se alcanzó el tejido adiposo o el músculo. Bajo el mismo aumento, se seleccionaron al azar 5 posiciones individuales para medir el grosor de la piel de cada uno de los 5 campos de visión por sección. Con la tinción de Tricrómico de Masson en todas las secciones, también se eligieron al azar 5 campos de visión diferentes y se analizaron para determinar la densidad de la fibra de colágeno.
2.3., Medición del contenido de agua
1 cm2 herida de la piel se recogió y se midió para el peso húmedo preciso, seguido de cocción a 80°C durante 12 horas antes de medir su peso seco. El contenido de agua de la piel se calculó mediante la fórmula del porcentaje de contenido de agua = ((peso húmedo − peso seco) ÷ peso húmedo) × 100%.
2.4. La medición del contenido de hidroxiprolina
el contenido de hidroxiprolina en la herida de la piel se midió de acuerdo con el protocolo de fabricación de kits de ensayo comerciales (Nanjing jianchen biological engineering Co., LTD, Nanjing, China).
2.5., Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR)
Las heridas cutáneas se homogeneizaron en TRIzol1 (Invitrogen) y el ARN total se extrajo de acuerdo con el protocolo del fabricante. 1 µg de ARN total se transcribió inversamente en ADNc utilizando el sistema de síntesis PrimeScript RT (Takara Biotechnology / Takara Bio, Dalian, China). Se realizó un método de PCR cuantitativa altamente sensible con estos productos de ADNc. Todos los cebadores y sondas personalizados fueron validados por su eficiencia (como se muestra en la Tabla 2)., La mezcla de reacción de 10 mL contenía 2x Power SYBR1 Green PCR Master Mix, 10 veces cDNA diluido y 0,2 mM de cada imprimación. El protocolo térmico consistió en 10 min de activación de la polimerasa a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 s, recocido de imprimación a 55°C durante 1 min y extensión A 72°C durante 30 s. Los niveles de expresión del ARNm se normalizaron a los del gen de referencia endógeno β-acción y se presentaron como cambios de pliegue a los obtenidos de muestras de piel control del envejecimiento. ,
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2.6. Statistical Analysis
Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., Se consideró que los resultados eran estadísticamente significativos a un nivel de probabilidad de .
3. Resultados
3.1. Cambios histológicos
el envejecimiento cutáneo mostró disminución del grosor tanto para la epidermis como para la dermis cuando se comparó con ratas control simuladas. Con el envejecimiento, la epidermis redujo su número de capas celulares, y las fibras de colágeno dérmicas se volvieron escasas, delgadas o rotas. Sin embargo, en comparación con el control del envejecimiento, estos cambios histológicos mejoraron en gran medida en los grupos de 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA y 0,2% DMAE (Figuras 1(a)-1(h)).
Cuando se trata con 0,1% DMAE + AA o 0.,2% DMAE + AA, tanto el espesor epidérmico como dérmico y la densidad de la fibra de colágeno fueron significativamente elevados sobre los del grupo control del envejecimiento. Además, el 0,2% de DMAE solo también aumentó significativamente el grosor epidérmico y la densidad de la fibra de colágeno en comparación con el control del envejecimiento. Pero, sin embargo, estos tres parámetros en todos los grupos de envejecimiento se regularon en gran medida a la baja cuando se compararon con los del grupo de control simulado (Figuras 2(a), 2(b) y 2(c)).
3.2. Contenido de agua en la piel envejecida
no hubo diferencias estadísticamente significativas en el contenido de agua entre todos los grupos (Figura 2 (d)).,
3.3. El contenido de hidroxiprolina en la piel envejecida
el contenido de hidroxiprolina aumentó en gran medida en la piel envejecida tratada con complejo DMAE + AA al 0,1% y DMAE + AA al 0,2%, lo que mostró diferencias significativas en comparación con todos los otros grupos de envejecimiento. Curiosamente, el contenido de hidroxiprolina en el grupo de 0.2% DMAE + AA alcanzó un nivel equivalente al del control simulado, pero fue significativamente mayor que todos los otros 6 grupos de envejecimiento. No hubo diferencia significativa entre los grupos de 0,1% DMAE + AA y 0,2% DMAE + AA (Figura 2(e)).
3.4., la expresión de ARNm de los Genes diana Tipo I, Procolágeno tipo III, MMP-1 y TIMP-1
la expresión de colágeno tipo I se incrementó en gran medida en respuesta a los tratamientos 0,1% DMAE + AA y 0,2% DMAE + AA, que no mostraron diferencia significativa con la del control simulado. Sin embargo, cualquiera de los otros grupos de envejecimiento mostró una expresión mucho menor de colágeno tipo I en comparación con las ratas control simuladas (Figura 3(a)). Cuando se trata con 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA, o 0.,2% DMAE solo, los niveles de transcripción para el colágeno tipo III fueron considerablemente elevados sobre el grupo control de envejecimiento, pero significativamente menores que el control simulado(Figura 3 (b)). Como potencial regulador clave en el envejecimiento de la piel, los mensajes MMP-1 aumentaron en respuesta al tratamiento con 0,1% de DMAE + AA o 0,2% de DMAE + AA, lo que mostró una diferencia estadísticamente significativa con respecto al control del envejecimiento, pero no con ratas de control ficticio (Figura 3(c)). En contraste, los niveles de transcripción para TIMP-1 en todos los grupos de envejecimiento se redujeron significativamente a un nivel mucho más bajo que el del control simulado (Figura 3(d)).,
(a)
(b)
(c)
(d)
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(d)
Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., La herida cutánea fue procesada y analizada para la expresión de colágeno tipo I (a), colágeno tipo III (B), MMP-1 (c) y su inhibidor, y TIMP-1 (D) por RT-PCR cuantitativa. Los niveles de expresión de cada gen objetivo se normalizaron a gen de referencia endógeno y se notificaron como valores relativos (ΔΔCt) a los obtenidos del grupo de control del envejecimiento. y † indican una diferencia significativa () cuando se comparan con el control negativo (Grupo 1) y el control simulado (grupo 8), respectivamente.
4., Discusión
La inyección de dosis bajas de D-galactosa en la piel de rata podría inducir cambios que se asemejan al envejecimiento acelerado. En nuestros estudios, el modelo de envejecimiento de la rata mostró cambios en el color del cabello, disminución de las actividades y deterioro neurológico. Los cambios histológicos de la piel inducida por el envejecimiento D-gal se presentaron como epidermis más delgada con capas de células reducidas y fibras de colágeno escasas, delgadas o rotas en la capa dérmica. Además, esta piel envejecida indicó niveles más bajos de contenido de hidroxiprolina y mensajes de ARNm para colágeno tipo I, tipo III, MMP-1 y TIMP-1 en comparación con el tejido normal de la piel., Todos estos datos sugieren que la inyección de 125 mg/kg·d D-galactosa durante 6 semanas es técnicamente factible para crear un modelo de envejecimiento subagudo para imitar el envejecimiento de la piel humana .
nuestros estudios indicaron que la coinyección de DMAE y AA aumentó los niveles de contenido de hidroxiprolina y la expresión de colágeno tipo I de la piel inducida por el envejecimiento D-gal, que alcanzó aproximadamente el mismo nivel de tejido cutáneo normal cuando se administró una dosis alta de 0,2% de tratamiento con DMAE + AA. Los cambios histológicos aparecieron como un grosor epidérmico y dérmico elevado y fibras de colágeno dérmicas bien dispuestas., Más interesante, la mesoterapia por coinyección de DMAE y AA elevó en gran medida la expresión génica de MMP-1 en la piel envejecida a un nivel equivalente de ratas normales, pero no por su inhibidor de TIMP-1 que se reguló significativamente a la baja en todas las ratas envejecidas. Estos resultados sugieren que la mesoterapia por coinyección de DMAE y AA jugó una regulación positiva sobre el catabolismo del colágeno en la reparación y reconstrucción de la piel envejecida y retrasó el proceso de envejecimiento de la piel., Estudios previos mostraron la reducción de la producción de colágeno tipo I y el aumento de la síntesis de colágeno tipo III y MMP-1 en la piel envejecida ; sin embargo, nuestros resultados indicaron que la expresión de ARNm para colágeno tipo III y MMP-1 fue mucho menor en el control del envejecimiento que la de ratas normales. Podría ser que el metabolismo del colágeno experimenta una manera diferente entre los cambios normales de la piel con el envejecimiento y el modelo de envejecimiento subagudo de la piel inducido por D-gal. Nuestro estudio también mostró que la inyección de DMAE o AA sola no mostró efectos sobre el contenido de hidroxiprolina o mensajes para el colágeno tipo I y MMP-1 en la piel envejecida., Estos datos indican que el uso concomitante de DMAE y AA podría ser la única manera de ejercer su acción antienvejecimiento en este modelo de envejecimiento cutáneo inducido por D-gal, modulando el metabolismo del colágeno tipo I y remodelando la estructura de la piel envejecida.
estudios previos han demostrado que los fibroblastos dérmicos de conejo cultivado respondieron a la DMAE por vacuolización masiva de una manera dependiente de la concentración. La epidermis de la oreja externa de conejo también se engrosó significativamente y exhibió una clara hinchazón perinuclear indicativa de vacuolización en respuesta a la aplicación tópica de DMAE al 3%., Se sugirió que la Citopatología vacuolar puede no ser disociable de la mejora de la apariencia de la piel que se produce rápidamente por DMAE administrado tópicamente y podría ser la base celular del efecto antiarrugas de DMAE . A partir de nuestros resultados, la vacuolización del fibroblasto dérmico podría ocurrir en piel envejecida tratada con DMAE al 0,1% y al 0,2%, lo que resulta en hinchazón celular y aumento de la densidad de la fibra de colágeno. Las células epiteliales de la piel envejecida también pudieron responder a la mayor concentración de DMAE del 0,2% por vacuolización, que se presentó como aumento del espesor epidérmico., Sin embargo, tal vez sea necesario realizar más estudios para aclarar esta cuestión.
Además, la medición del contenido de agua de la piel no mostró diferencias entre todas las ratas tratadas, lo que sugiere que el DMAE y el compuesto AA tuvieron efectos limitados en la hidratación de la piel. Esto podría deberse a un menor nivel de concentración y un período de acción más corto de DMAE local disponible en la capa epidérmica cuando se utilizó la inyección subcutánea directa para la administración de DMAE, lo que difiere de la aplicación tópica de DMAE.
5., Conclusiones
con el modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa de rata, la mesoterapia mediante la administración de DMAE y AA directamente al tejido diana tiene efectos antienvejecimiento marcados al promover la síntesis de colágeno y el catabolismo para remodelar la textura de la piel y mejorar el grosor de la piel envejecida. Aunque estos experimentos utilizaron un modelo de rata, los resultados son relevantes para los trabajos clínicos., Investigaciones adicionales para comprender el mecanismo de la acción del dimetilaminoetanol y el aminoácido compuesto en el envejecimiento de la piel ayudarán en el desarrollo y la prueba de regímenes de cuidado de la piel más potentes y efectivos para una evaluación humana posterior.
Conflicto de Intereses
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este documento.