Recuento de células mediante hemocitómetro
Figura 1. Líneas de cuadrícula del hemocitómetro.Diagrama del hemocitómetro que indica uno de los conjuntos de 16 cuadrados que deben usarse para el conteo.
transcripción del Webinar
El Conteo de células permite la determinación precisa de los números celulares y, por lo tanto, la consistencia entre los experimentos. Este video describirá el procedimiento para contar tanto las células de suspensión como las de adherencia utilizando un hemocitómetro.
antes de comenzar el trabajo, rocíe a fondo el interior del gabinete de seguridad de flujo laminar con desinfectante y limpie con tejido., Deseche el tejido usado en el contenedor de basura apropiado. A continuación, rocíe el interior de la capucha con etanol al 70% y limpie con tejido. La campana está ahora limpia y lista para usar. Retire los medios de cultivo celular y la tripsina del refrigerador y colóquelos en una incubadora de dióxido de carbono humidificada de 37 grados C para que se caliente. Mientras tanto, observe las células a contar con un microscopio para verificar si hay signos visuales de contaminación bacteriana y fúngica. Rocíe botellas y pipetas de medios con etanol al 70% antes de jugar en el gabinete de seguridad de flujo laminar.,
para las células de suspensión, agitar suavemente el matraz para asegurar que las células estén bien mezcladas. Antes de que tengan la oportunidad de asentarse, tome una muestra de 0,5 mililitros de suspensión celular y pipetee en un tubo Eppendorf estéril. Para las células de adherencia, retire el medio existente, lave con PBS a temperatura ambiente y agregue tripsina EDTA para separar las células. Consulte la tabla uno para conocer los volúmenes de PBS y tripsina requeridos. Incubar las células durante dos a cinco minutos en la incubadora de dióxido de carbono humidificada a 37 grados C. El tiempo de incubación tendrá que ser optimizado para el tipo de célula., Cuando todas las células se desprendan, neutralice la tripsina EDTA con suero caliente que contenga medios de crecimiento apropiados para las células y el cultivo. Consulte la tabla uno para conocer los volúmenes requeridos.
vuelva a suspender las células pipeteando suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo tres veces y transfiéralas a un tubo de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 1.000 revoluciones por minuto a temperatura ambiente., Retire el sobrenadante utilizando un pipet serológico estéril y vuelva a suspender la paleta celular con suero de 37 grados C que contiene medios de crecimiento al volumen original del cultivo inicial. Usando una pipeta estéril de cinco mililitros, tome una muestra de 0,5 mililitros de suspensión celular y transfiera a un tubo Eppendorf estéril.
para estar contando, prepare el hemocitómetro desechable. Usando una pipeta Gilson P2000, tomar 100 microlitros de suspensión, y añadir a 400 microlitros de Trypan blue, nota,.08% y mezclar bien., Tome 100 microlitros de la mezcla de suspensión Trypan blue cell y pipetee cuidadosamente una gota de la suspensión en el pozo de la cámara de conteo, permitiendo que la acción capilar atraiga la muestra. Tenga cuidado de no llenar la cámara de conteo. Vea el área de conteo con un aumento de 10 veces usando un microscopio invertido. Usando el microscopio, enfóquese en una de las cuadrículas de cuatro por cuatro en el hemocitómetro y cuente las células con un negativo para azul de tripano. Estos son viables. Además, tome nota de cuántas células fueron positivas para Trypan blue., Estas células están muertas, y este número se puede usar más tarde para calcular el porcentaje de viabilidad del cultivo si es necesario.
al contar, emplee un sistema por el cual las celdas solo se cuentan cuando están dentro de un cuadrado, o en la mano derecha o en la línea de límite inferior. Registre el número de células contadas en este conjunto de 16 cuadrados y mueva el hemocitómetro hasta que se hayan contado los cuatro conjuntos de 16 cuadrados en el hemocitómetro y se hayan registrado sus valores., Para calcular la concentración celular, tome el número promedio de células viables en los cuatro conjuntos de 16 cuadrados y multiplíquelo por 10,000 para obtener el número de células por mililitro. Luego, multiplique esto por cinco para corregir la dilución de uno en cinco de la adición de Trypan blue. Este valor final es el número de células viables por mililitro en la suspensión celular original.,
por ejemplo, si su recuento de células viables es de 200,000 células por mililitro en un volumen de 20 mililitros y desea ver 10,000 células en el nuevo matraz, entonces debe transferir 50 microlitros de su suspensión celular al nuevo matraz. Transferir el volumen necesario de suspensión celular al nuevo matraz. Rellénalo con medios y colócalo en la incubadora.