resolución del microscopio: conceptos, factores y cálculo
Teniendo en cuenta todas las teorías anteriores, está claro que hay una serie de factores a considerar al calcular los límites teóricos de resolución. La resolución también depende de la naturaleza de la muestra. Veamos el cálculo de la resolución usando el límite de difracción de Abbe y también usando el criterio de Rayleigh.,
en primer lugar, debe recordarse que:
NA= n x Sin α
donde n es el índice de refracción del medio de imagen y α es la mitad de la apertura angular del objetivo. La apertura angular máxima de un objetivo es de alrededor de 144º. El seno de la mitad de este ángulo es 0.95. Si se utiliza un objetivo de inmersión con aceite que tiene un índice de refracción de 1,52, el NA máximo del objetivo será 1,45. Si se utiliza un objetivo ‘ seco ‘(sin inmersión), el NA máximo del objetivo será 0,95 (ya que el aire tiene un índice de refracción de 1,0).
la fórmula de difracción de Abbe para lateral (i. e., XY) la resolución es:
d = λ / 2 NA
donde λ es la longitud de onda de la luz utilizada para la imagen de una muestra. Si se utiliza una luz verde de 514 nm y un objetivo de inmersión en aceite con un NA de 1,45, entonces el límite (teórico) de resolución será de 177 nm.
la fórmula de difracción de Abbe para la resolución axial (es decir, Z) ES:
d= 2 λ/NA2
nuevamente, si asumimos una longitud de onda de 514 nm para observar una muestra con un objetivo de valor NA de 1.45, entonces la resolución axial será de 488 nm.
El Criterio de Rayleigh es una fórmula ligeramente refinada basada en los límites de difracción de Abbe:
R = 1.,22 λ / NAobj + NAcond
donde λ es la longitud de onda de la luz utilizada para la imagen de una muestra. NAobj es la NA del objetivo. NAcond es la NA del condensador. La figura de ‘1.22’ es una constante. Esto se deriva del trabajo de Rayleigh sobre las funciones de Bessel. Estos se utilizan para calcular problemas en sistemas como la propagación de ondas.
Teniendo en cuenta el NA del condensador, el aire (con un índice de refracción de 1.0) es generalmente el medio de imagen entre el condensador y el portaobjetos. Suponiendo que el condensador tiene una apertura angular de 144º, entonces el valor de NAcond será igual a 0.95.,
Si se utiliza una luz verde de 514 nm, un objetivo de inmersión en aceite con un NA de 1.45, condensador con un NA de 0.95, entonces el límite (teórico) de resolución será de 261 nm.
como se indicó anteriormente, cuanto más corta sea la longitud de onda de la luz utilizada para la imagen de una muestra, más detalles se resolverán. Por lo tanto, si se utiliza la longitud de onda visible más corta de la luz de 400 nm, con un objetivo de inmersión en aceite con un NA de 1,45 y un condensador con un NA de 0,95, entonces R sería igual a 203 nm.,
para lograr la máxima resolución (teórica) en un sistema de microscopio, cada uno de los componentes ópticos debe ser del NA más alto disponible (teniendo en cuenta la apertura angular). Además, el uso de una longitud de onda de luz más corta para ver la muestra aumentará la resolución. Finalmente, todo el sistema de microscopio debe estar correctamente alineado.