Solujen laskeminen hemosytometrillä
kuva 1. Hemocytometer gridlines.
Hemocytometer-kaavio, joka osoittaa yhden 16 neliön joukon, jota olisi käytettävä laskemiseen.
Webinaarin transkriptio
Counting-solujen avulla tarkka määrittäminen solujen määrä, ja siksi johdonmukaisuus kokeiluja. Tässä videossa esitetään menettely sekä suspensio-että kiinnittymissolujen laskemiseksi hemosytometrillä.
ennen töiden aloittamista ruiskuta laminaarivirtauskaapin sisäpuoli huolellisesti desinfiointiaineella ja pyyhi puhtaaksi kudoksella., Hävitä käytetty kudos asianmukaiseen jäteastiaan. Seuraavaksi suihkuta Konepellin sisäpuolelle 70% etanolia ja pyyhi puhtaaksi kudoksella. Konepelti on nyt puhdas ja käyttövalmis. Poista kennoviljelmät ja trypsiini jääkaapista ja aseta kostutettuun, 37-asteiseen C: hen, hiilidioksidin hautomo lämpiämään. Samaan aikaan, katso soluja lasketaan mikroskoopilla tarkistaa mitään visuaalisia merkkejä bakteeri-ja sieni saastumisen. Suihkuta mediapulloja ja pipettiä 70% etanolilla ennen kuin pelaat laminar flow – turvakaapissa.,
suspensiosolujen osalta pulloa ravistetaan varovasti, jotta solut sekoittuvat hyvin. Ennen kuin ne saavat mahdollisuuden asettua, ota 0,5 millilitran näyte solususpensiota ja pipetistä steriiliin Eppendorf-putkeen. Noudattamisen soluja, poistaa nykyiset media, pese vedellä huoneenlämmössä PBS, ja lisää trypsiini-EDTA irrottaa soluja. KS.taulukossa 1 vaaditut PBS-ja trypsiinimäärät. Hautoa soluja kahdesta viiteen minuuttia kostutetussa 37 C-asteessa, hiilidioksidin hautomossa. Itämisaika on optimoitava solutyypille., Kun kaikki solut irrotetaan, neutraloi trypsiinin EDTA lämpimällä seerumilla, joka sisältää soluille ja viljelylle sopivia kasvualustoja. Katso taulukosta yksi vaaditut määrät.
suspendoi solut uudelleen pipetoimalla solususpensiota varovasti ylös ja alas kolme kertaa ja siirtämällä ne 50 millilitran putkeen. Sentrifugoi kennosuspensiota viisi minuuttia 1 000 kierrosta minuutissa huoneenlämmössä., Poista supernatantti käyttämällä steriiliä serologinen pipetoi ja uudelleen keskeyttää solun paletti 37 asteen C-seerumi, joka sisältää kasvua median alkuperäinen tilavuus alkaen kulttuuri. Käyttämällä viisi millilitraa steriiliä pipetoi, ottaa ja 0,5 millilitran näyte solususpensiota, ja siirtää steriiliin eppendorf-putkeen.
lasketaan, valmistetaan kertakäyttöinen hemosytometri. Ota P2000 Gilson-pipetillä 100 mikrolitraa suspensiota ja lisää 400 mikrolitraa trypansinistä, Huom .08% ja sekoita hyvin., Ota 100 mikrolitraa of trypan blue solususpensiota sekoitetaan, ja huolellisesti pipetoi tippa jousitus osaksi hyvin counting jaosto, jonka avulla kapillaari vetää näyte. Varo täyttämästä laskukammiota liikaa. Katso laskualuetta 10 kertaa suurennettuna käänteisellä mikroskoopilla. Mikroskoopin avulla keskity yhteen hemosytometrin neljästä ruudukosta ja laske solut negatiivisiksi trypansiniselle. Nämä ovat elinkelpoisia. Huomaa myös, kuinka monet solut olivat positiivisia trypansiniselle., Nämä solut ovat kuolleet, ja tätä lukua voidaan käyttää myöhemmin laskemaan viljelmän prosentuaalinen elinkelpoisuus tarvittaessa.
kun lasketaan, käytetään järjestelmää, jossa solut lasketaan vain silloin, kun ne ovat neliön sisällä tai oikealla puolella tai alarajalla. Ennätys solujen määrä lasketaan tässä sarja 16 ruutua ja siirrä hemocytometer, kunnes kaikki neljä sarjaa 16 neliöitä hemocytometer on laskettu, ja niiden arvot kirjataan., Laskea solujen pitoisuus, ota keskimääräinen määrä elinkelpoisia soluja neljä sarjaa 16 ruutua ja kerrotaan 10 000: sta saada solujen määrä millilitrassa. Sitten, kerrotaan tämä viidellä korjata yksi viidestä laimennuksesta trypan sininen lisäys. Tämä lopullinen arvo on alkuperäisen solususpension elinkykyisten solujen määrä millilitraa kohti.,
esimerkiksi, jos elinkelpoisten solujen määrä on 200 000 solua millilitrassa tilavuus on 20 ml ja haluat nähdä 10 000 solua uuteen pulloon, sitten sinun täytyy siirtää 50 mikrolitraa teidän cell jousitus uuteen pulloon. Siirretään tarvittava määrä solususpensiota uuteen pulloon. Lisää mediaa ja laita hautomoon.