Comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre
Figure 1. Lignes quadrillées de l’hémocytomètre.
Diagramme D’hémocytomètre indiquant l’un des ensembles de 16 carrés qui doivent être utilisés pour le comptage.
transcription du webinaire
le comptage des cellules permet de déterminer avec précision le nombre de cellules, et donc la cohérence entre les expériences. Cette vidéo décrit la procédure de comptage des cellules de suspension et d’adhérence à l’aide d’un hémocytomètre.
avant de commencer le travail, vaporisez soigneusement l’intérieur de l’armoire de sécurité à flux laminaire avec un désinfectant et essuyez-le avec un mouchoir en papier., Jeter les mouchoirs usagés dans la poubelle appropriée. Ensuite, vaporisez l’intérieur de la hotte avec de l’éthanol à 70% et essuyez avec du tissu. La hotte est maintenant propre et prête à l’emploi. Retirez les milieux de culture cellulaire et la trypsine du réfrigérateur et placez-les dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés C pour les réchauffer. Pendant ce temps, regardez les cellules à compter à l’aide d’un microscope pour vérifier tout signe visuel de contamination bactérienne et fongique. Vaporisez les bouteilles de média et la pipette avec de l’éthanol à 70% avant de jouer dans l’armoire de sécurité à flux laminaire.,
Pour les cellules en suspension, agiter doucement le flacon pour s’assurer que les cellules sont bien mélangés. Avant qu’ils aient une chance de s’installer, prenez un échantillon de 0,5 millilitre de suspension cellulaire et pipet dans un tube stérile d’eppendorf. Pour les cellules d’adhérence, retirez les milieux existants, lavez avec du PBS à température ambiante et ajoutez de la trypsine EDTA pour détacher les cellules. Reportez-vous au tableau un pour les volumes de PBS et de trypsine requis. Incuber les cellules pendant deux à cinq minutes dans l’incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés C. Le temps d’incubation devra être optimisé pour le type de cellule., Lorsque toutes les cellules sont détachées, neutraliser la trypsine EDTA avec du sérum chaud contenant des milieux de croissance appropriés aux cellules et à la culture. Reportez-vous au Tableau Un pour le volume.
re-suspendre les cellules en pipetant doucement la suspension cellulaire de haut en bas trois fois et les transférer dans un tube de 50 millilitre. Centrifuger la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 1 000 tours par minute à température ambiante., Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique stérile et suspendre à nouveau la palette cellulaire avec un sérum de 37 degrés C contenant des milieux de croissance au volume initial de la culture de départ. À l’aide d’une pipette stérile de cinq millilitres, prélevez un échantillon de suspension cellulaire de 0,5 millilitre et transférez-le dans un tube stérile d’eppendorf.
pour compter, préparez l’hémocytomètre jetable. En utilisant une pipette P2000 Gilson, prendre 100 microlitres de suspension, et ajouter à 400 microlitres de trypan bleu, note,.08% et bien mélanger., Prélevez 100 microlitres du mélange de suspension trypan blue cell et pipetez soigneusement une goutte de la suspension dans le puits de la chambre de comptage, ce qui permet à l’action capillaire de prélever l’échantillon. Veillez à ne pas trop remplir la chambre de comptage. Visualisez la zone de comptage sous un grossissement 10 fois à l’aide d’un microscope inversé. À l’aide du microscope, concentrez-vous sur l’une des grilles quatre par quatre de l’hémocytomètre et comptez les cellules à un négatif pour le bleu de trypan. Ceux-ci sont viables. Notez également combien de cellules étaient positives pour le bleu de trypan., Ces cellules sont mortes, et ce nombre peut être utilisé plus tard pour calculer le pourcentage de viabilité de la culture si nécessaire.
lors du comptage, utilisez un système par lequel les cellules ne sont comptées que lorsqu’elles se trouvent dans un carré, ou sur la ligne de démarcation droite ou inférieure. Enregistrez le nombre de cellules comptées dans cet ensemble de 16 carrés et déplacez l’hémocytomètre jusqu’à ce que les quatre ensembles de 16 carrés de l’hémocytomètre aient été comptés et leurs valeurs enregistrées., Pour calculer la concentration cellulaire, prenez le nombre moyen de cellules viables dans les quatre ensembles de 16 carrés et multipliez par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par millilitre. Ensuite, multipliez cela par cinq pour corriger la dilution d’une sur cinq de l’addition de bleu de trypan. Cette valeur finale est le nombre de cellules viables par millilitre dans la suspension cellulaire d’origine.,
par exemple, si votre nombre de cellules viables est de 200 000 cellules par millilitre dans un volume de 20 millilitres et que vous souhaitez voir 10 000 cellules dans le nouveau flacon, vous devez transférer 50 microlitres de votre suspension cellulaire dans le nouveau flacon. Transférer le volume de suspension cellulaire dans le nouveau flacon. Complétez avec des médias et mettez-les dans l’incubateur.