des méthodes d’identification des staphylocoques à coagulase négative
caractérisation biochimique
comparaison des méthodes d’identification des staphylocoques à coagulase négative
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana va SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Microbiologia e Imunologia
Iidepartamento de bioestatística, Instituto de biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil
résumé
l’identification des espèces de staphylocoques à coagulase négative (SNC) est encore difficile pour la plupart des Laboratoires Cliniques., Le schéma proposé par Kloos et Schleifer et modifié par Bannerman est la méthode de référence utilisée pour l’identification des espèces et sous-espèces staphylococciques; cependant, cette méthode est relativement laborieuse pour une utilisation courante car elle nécessite l’utilisation d’un grand nombre de tests biochimiques. L’objectif de la présente étude était de comparer quatre méthodes, à savoir la méthode de référence, le système API staphylocoque (bioMérieux) et deux méthodes modifiées à partir de la méthode de référence dans notre laboratoire (méthode simplifiée et méthode disque), dans l’identification de 100 souches du SNC., Par rapport à la méthode de référence, la méthode simplifiée et la méthode du disque ont correctement identifié 100 et 99% des espèces du SNC, respectivement, alors que ce taux était de 84% pour le système API staphylocoque. Une identification inexacte par la méthode API Staphylococcus epidermidis a été observée pour Staphylococcus epidermidis (2,2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37,5%) et S. warneri (47,1%)., La méthode simplifiée utilisant le schéma d’identification simple proposé dans la présente étude s’est avérée efficace pour toutes les souches testées, avec une sensibilité et une spécificité à 100% et s’est avérée être une alternative disponible pour l’identification des staphylocoques, offrant une fiabilité supérieure et un coût inférieur aux systèmes commerciaux actuellement disponibles. Cette méthode serait très utile en laboratoire de microbiologie clinique, en particulier dans les endroits avec des ressources limitées.,
mots clés: staphylocoques à coagulase négative-méthodes-identification-API Staphylococcus
quarante espèces du genre Staphylococcus ont été identifiées à ce jour (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et coll. 2003). S., aureus, une espèce à coagulase positive qui produit une série d’autres enzymes et toxines, est la plus connue et a été fréquemment impliquée dans l’étiologie d’une série d’infections et d’intoxications chez les animaux et les humains, tandis que les staphylocoques à coagulase négative (SNC), représentant la majorité des espèces, ont été considérés comme saprophytes ou rarement pathogènes (Kloos & Schleifer 1975)., Au cours de la dernière décennie, cependant, les SNC ont été reconnus comme les agents étiologiques d’une série de processus infectieux, représentant les micro-organismes le plus souvent isolés des hémocultures (Huebner & Goldmann 1999).
Environ la moitié des espèces du SNC colonisent naturellement les humains, et à l’heure actuelle, elles sont considérées comme des agents étiologiques essentiellement opportunistes, qui prévalent dans de nombreuses situations organiques pour produire des infections graves (Bannerman 2003)., L’émergence du SNC en tant que pathogènes de différentes infections peut être le résultat de l’utilisation croissante de procédures invasives telles que les cathéters intravasculaires et les prothèses chez les patients subissant un traitement intensif, les patients immunodéprimés, les enfants prématurés, les patients atteints de néoplasies et les patients transplantés (Kloos & Bannerman 1994).
Les espèces qui causent le plus souvent des maladies chez L’homme sont S., epidermidis (bactériémie, infections dues à des dispositifs médicaux implantés tels que prothèses et cathéters, infection de plaies chirurgicales, péritonite chez les patients en dialyse péritonéale continue, ostéomyélite, endophtalmie, etc.), S. haemolyticus (endocardite, péritonite, septicémie et infections des voies urinaires, des plaies, des os et des articulations) et S. saprophyticus (infections urinaires et processus septicémiques). D’autres pathogènes opportunistes importants comprennent S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus et S. saccharolyticus (Bannerman, 2003). S., lugdunensis semble être associé à une endocardite après implantation de valves prothétiques, à une péritonite, à une infection des tissus mous et à une ostéomyélite vertébrale (Osmon et al. 2000).
compte tenu du potentiel pathogène connu du SNC dans le milieu hospitalier, l’intérêt pour la variété des espèces liées à l’infection et leur potentiel toxigène et leur virulence a augmenté au cours de la dernière décennie et a conduit à la publication de diverses études sur ces aspects., Cependant, malgré la caractérisation croissante des infections du SNC, ces micro-organismes ne sont pas identifiés dans les laboratoires de microbiologie clinique. Le schéma proposé par Kloos et Schleifer (1975) et modifié par Bannerman (2003) est la méthode classiquement utilisée; cependant, cette méthode est relativement laborieuse pour une utilisation de routine car un grand nombre de tests biochimiques sont nécessaires., Dans la plupart des laboratoires de routine, les staphylocoques sont identifiés sur la base des aspects morphologiques des colonies, de la coloration de gram et de la production de catalase et de coagulase, qui ne permettent que la classification des staphylocoques en isolats de S. aureus et non-S. aureus, ces derniers étant simplement classés comme SNC.
le développement de méthodes d’identification des espèces et sous-espèces staphylococciques permet aux cliniciens d’obtenir des informations sur la variété de SNC présente dans les échantillons cliniques et de les considérer comme des agents étiologiques des processus infectieux., Une identification précise du SNC est nécessaire pour avoir une prédiction précoce de la pathogénicité potentielle ou de la sensibilité aux antibiotiques de chaque isolat clinique et pour clarifier la signification clinique de chaque espèce. Des isolats répétés du SNC provenant de patients atteints de maladies invasives doivent être identifiés pour permettre une comparaison des souches. D’autre part, l’identification des espèces est une condition préalable avant d’entreprendre des procédures de typage pour les études épidémiologiques.,
au cours des dernières années, plusieurs systèmes commerciaux d’identification rapide des staphylocoques ont été développés comme alternative aux protocoles d’identification classiques (Bannerman 2003). Cependant, ces systèmes de diagnostic présentent des problèmes tels que le coût et le temps d’incubation, fournissent souvent des résultats peu fiables (Grant et al. 1994, Perl et coll. 1994). De plus, bon nombre de ces trousses ont été conçues pour l’identification de toutes les espèces connues du SNC (c.-à-d. les isolats cliniques, vétérinaires et alimentaires) et ne sont donc pas très spécifiques., Sur la base des considérations ci-dessus et compte tenu de la nécessité de méthodes rapides, simples et fiables, l’objectif de la présente étude était de comparer quatre techniques d’identification du SNC, c’est-à-dire une méthode de référence (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), le système commercial API Staph, et deux méthodes modifiées de la méthode de référence dans notre laboratoire pour développer des méthodes ressources.,
matériaux et méthodes
isolats – une centaine d’isolats du SNC obtenus à partir de spécimens cliniques de patients hospitalisés à l’Hôpital Universitaire de la Faculté de Médecine, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de Botucatu, ont été étudiés. Les souches ont été isolées comme décrit par Koneman et al. (1997).
Identification du SNC – les isolats obtenus à partir d’échantillons cliniques ont été plaqués sur gélose sanguine et colorés en gram afin de garantir leur pureté et la préservation de leur morphologie et de leur coloration spécifique., Après confirmation de ces caractéristiques, les isolats ont été soumis aux tests de catalase et de coagulase. Le staphylocoque a été différencié des espèces de Micrococcus en fonction de l’oxydation et de la fermentation du glucose, de la résistance à la bacitracine (0,04 U) indiquée par l’absence d’un halo d’inhibition ou la présence d’un halo d’inhibition mesurant jusqu’à 9 mm de diamètre et de la sensibilité à la furazolidone (100 µg) caractérisée par des zones d’inhibition mesurant de 15 à 35 mm de diamètre (Baker, 1984).
Les quatre méthodes décrites ci-dessous ont été utilisées pour l’identification du SNC., Les souches internationales de référence du SNC suivantes ont été utilisées comme témoins: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979) et S. saprophyticus (ATCC 15305).,
méthode de référence proposée par Kloos et Schleifer (1975) et Bannerman (2003) – cette méthode consiste en un ensemble de tests biochimiques qui déterminent l’utilisation des sucres xylose, arabinose, saccharose, tréhalose, maltose, mannitol, lactose, xylitol, ribose, fructose et mannose, la production d’hémolysine, la réduction des nitrates, la présence d’uréase et d’ornithine décarboxylase, et la résistance à la novobiocine un halo d’inhibition allant jusqu’à 16 mm. les lectures des tests ont été obtenues après 24, 48 et 72 h d’incubation à 37ºC dans un incubateur à air.,
API Staph – le système API Staph (bioMérieux) est une batterie de test prête à l’emploi composée de 20 tests biochimiques auxquels est ajoutée une suspension bactérienne homogène à 0,5 McFarland turbidité. Après 24 h d’incubation à 37ºC et l’ajout des réactifs VP (VP1 et VP2), NIT (NIT1 et NIT2) et PAL (ZYM A et ZYM B) accompagnant le kit, les réactions ont été interprétées et les microorganismes identifiés à l’aide du catalogue analytique., L’Identification est basée sur un système numérique composé de sept chiffres qui fournit un pourcentage d’identification (%ID), une valeur > 80% étant acceptable.
méthodes modifiées – deux méthodes d’identification modifiées dans notre laboratoire ont été utilisées (méthode simplifiée et méthode du disque). La méthode simplifiée a été divisée en deux étapes. Au cours de la première étape, la fermentation du xylose, du saccharose, du tréhalose, du maltose et du mannitol, la production d’hémolysine et la croissance anaérobie du thioglycolate ont été testées (Tableau I)., Les tests utilisés dans la deuxième étape ont varié en fonction des résultats obtenus dans la première étape d’identification après une incubation de 72 h à 37ºC. Les tests complémentaires utilisés lors de la deuxième étape (si nécessaire) sont spécifiés dans le tableau II.
La méthode sur disque comprenait les tests suivants: fermentation de l’arabinose, du saccharose, du tréhalose, du maltose, du mannitol et du lactose, réduction des nitrates, production d’hémolysine, tests d’uréase et d’ornithine décarboxylase et résistance à la novobiocine., Pour l’essai de fermentation du sucre, des disques disponibles dans le commerce spécifiques à chaque sucre ont été placés dans des tubes contenant 2,5 ml de milieu de base de Bouillon Violet. Des suspensions bactériennes ont été inoculées comme décrit par Kloos et Schleifer (1975). Les lectures pour les deux méthodes ont été obtenues après 24, 48 et 72 h d’incubation à 37ºC, et les espèces du SNC ont été identifiées selon le schéma d’identification proposé sur la Figure.,
analyse statistique – pour déterminer le degré d’accord entre les méthodes utilisées pour l’identification du SNC (méthode simplifiée, méthode du disque et API Staph) et la méthode de référence (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), la sensibilité et la spécificité des tests (Sox 1986) ont été évalués comme suit.,
sensibilité: proportion de souches du SNC qui ont été testées positives pour une certaine espèce par la méthode de référence et qui ont été identifiées comme la même espèce par la méthode analysée (méthode simplifiée, disque ou API Staph).
spécificité: proportion de souches du SNC qui se sont révélées négatives pour une certaine espèce par la méthode de référence et qui étaient également négatives pour la même espèce lorsqu’elles ont été testées par la méthode analysée (méthode simplifiée, disque ou API Staph).
résultats
Les 100 isolats staphylococciques ont été testés par les quatre méthodes proposées., Les résultats obtenus avec la méthode de référence (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) ont été comparés à ceux obtenus avec les méthodes modifiées et le système API Staph.
le tableau III montre l’accord d’identification entre les essais analysés et la méthode de référence. La méthode simplifiée et la méthode du disque ont montré une positivité de 100 et 99% par rapport à la méthode de référence, alors que ce pourcentage était de 84% pour le système API Staph. Sur les 16 isolats avec désaccord d’identification par la méthode API staphylocoque, 10 (62.,5%) ont montré une identification correcte mais avec un % ID de 7,1 à 31%, inférieur à la valeur acceptable.
la méthode simplifiée réalisée en deux étapes ne différait pas de la méthode de référence en termes d’identification des espèces du SNC. Contrairement aux autres méthodes, la méthode du disque a montré une identification inexacte et a identifié par erreur une souche de S. hominis (6,5%) en raison de la non-fermentation du saccharose sur le disque, conduisant à la classification de cette souche comme S. caprae. Aucune incompatibilité n’a été observée pour les autres espèces.,
l’écart le plus important a été observé entre la méthode de référence et le système de staphylocoque API, cette dernière méthode n’identifiant pas avec précision 1 souche de S. epidermidis (identifiée comme S. lugdunensis), 3 souches de S. haemolyticus (2 identifiées comme S. aureus et 1 comme S. hominis), 4 souches de S. hominis (2 identifiées comme S. lugdunensis, 1 comme S. haemolyticus et 1 comme S. aureus) et 8 souches de S. warneri (3 identifiées comme S. Lugdunensis, 2 comme S. haemolyticus, 2 comme S. hominis et 1 comme S. saprophyticus) (Tableau III).,
DISCUSSION
Les SNC sont les microorganismes les plus souvent isolés des hémocultures, ce qui représente un grave problème de santé dans de nombreux pays en développement et également développés (Renneberg et al. 1995). Certaines études ont suggéré une association entre S. epidermidis et les infections nosocomiales (Vuong & Otto 2002) cette espèce étant identifiée chez 74 à 92% des patients atteints de bactériémies causées par le SNC (Martin et al. 1989). Cependant, d’autres études ont rapporté une série d’infections causées par d’autres espèces du SNC (Herwaldt et al. 1996), principalement S., haemolyticus qui est la deuxième espèce la plus fréquemment détectée (Bannerman, 2003). Étant donné que les SNC sont les agents étiologiques d’une série de processus infectieux, l’identification de ces micro-organismes est importante pour la détermination de leurs caractéristiques physiopathologiques et de leur importance clinique et pour les études épidémiologiques, et a conduit à la publication de diverses études analysant les méthodes d’identification de ces bactéries (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et coll. 1994, Renneberg et coll. 1995, Ieven 1995, de Paulis et coll. 2003).,
dans la présente étude, les méthodes modifiées dans notre laboratoire ont donné de bons résultats en termes de classification correcte des espèces du SNC par rapport à la méthode de référence, avec un accord de 100% pour la méthode modifiée simplifiée et un accord de 99% pour la méthode du disque.
la méthode simplifiée utilisant la méthode d’identification proposée ici (Figure) a conduit à l’identification de S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis et S. simulans en une seule étape, en utilisant un total de sept tests biochimiques, un nombre inférieur à celui utilisé dans la méthode de référence (16 tests)., Étant donné que S. epidermidis est l’espèce la plus fréquemment isolée, 70 à 90% des souches (Bannerman 2003) isolées en laboratoire clinique peuvent être identifiées en utilisant un nombre réduit de tests.
en ce qui concerne le temps d’incubation, les résultats ont montré que 91% des souches analysées dans l’étude ont fermenté le sucre spécifique à l’espèce dans les 48 h suivant l’incubation à 37ºC., Les autres souches (9%) ont été testées positives pour la fermentation de sucres donnés après 72 h d’incubation, démontrant l’importance d’une incubation des tests de fermentation des sucres d’au moins 72 h afin d’identifier correctement ces micro-organismes.
l’identification de S. cohnii, S. schleiferi sous-espèces schleiferi, S. caprae, s. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus et S. lugdunensis a nécessité l’exécution de deux ou trois tests biochimiques supplémentaires, appelés deuxième étape, qui ont varié selon le résultat obtenu lors de la première étape de la méthode simplifiée., Cependant, 20 souches (37,7%) qui nécessitaient la deuxième étape pour leur identification ont fermenté le tréhalose en 24 h, ce qui a permis la poursuite préalable des tests supplémentaires. Il a fallu plus de temps pour identifier S. cohnii, S. schleiferi sous-espèces schleiferi et S. caprae, puisque la deuxième étape nécessaire à l’identification de ces espèces comprenait le test de réduction des nitrates dont le résultat n’est disponible qu’après 48 h. Cependant, ce fait n’entraîne pas réellement de retard dans le diagnostic du SNC puisque la fréquence de ces espèces dans les échantillons cliniques est faible. ,
la méthode du disque s’est également avérée très efficace et pratique car elle ne nécessite pas de préparation préalable de sucres, empêchant ainsi la perte de milieux de culture, en plus d’atteindre un accord élevé dans l’identification du SNC avec la méthode de référence.
Le kit commercial API Staph a montré la plus faible précision dans l’identification du SNC parmi les méthodes étudiées (84% d’accord), en accord avec les études de (Bannerman et al. 1993, Renneberg et coll. 1995).
S. warneri et S. hominis étaient les espèces les plus difficiles à identifier. Bannerman et coll., (1993) ont également signalé une plus faible précision dans l’identification de ces espèces. Dans l’étude de Ieven et coll. (1995), S. hominis a été identifié avec le moins de précision par le système de staphylocoque API ID 32. Cette constatation pourrait s’expliquer par l’absence de tests complémentaires tels que la résistance à la novobiocine, la croissance anaérobie du thioglycolate et la production d’hémolysine.
Dans le cas de S., haemolyticus, une identification incorrecte par le système API staphylococcique pourrait s’expliquer par le fait que le kit ne suggère pas la production d’hémolysine comme test complémentaire, ce qui serait essentiel pour l’identification des souches de S. haemolyticus.
Trois (3%) des 100 souches analysées par le système API staphylocoque ont été identifiées comme S. aureus, un fait également rapporté par Renneberg et al. (1995). Le kit s’est avéré inefficace dans ces cas puisqu’il n’a pas demandé le résultat du test fondamental et le plus largement accepté pour l’identification de S. aureus, c’est-à-dire,, le test de la coagulase (Koneman et al. 1997).
Selon Piccolomini et coll. (1994), le faible accord entre le staphylocoque API et le test biochimique traditionnel pour l’identification du SNC peut s’expliquer par l’utilisation de différents temps d’incubation, concentrations de substrat et/ou marqueurs de sensibilité.,
En conclusion, les deux méthodes modifiées dans notre laboratoire se sont avérées très efficaces pour une utilisation de routine en raison de leur grande sensibilité et de leur spécificité par rapport à la méthode de référence, en plus de nécessiter moins d’essais et d’être ainsi plus économiques et plus rapides que la méthode standard. Bien que nécessitant un temps d’incubation plus court (18 h), le système de staphylocoque API a montré une sensibilité plus faible dans l’identification de certaines espèces., Sans aucun doute, l’identification des espèces du SNC sera facilitée et encouragée par la disponibilité d’une procédure simple, peu coûteuse et précise, en particulier dans les endroits où les ressources sont limitées.
remerciements
à bioMérieux pour le Don des kits API staphylococciques utilisés dans la présente étude.
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