résolution du Microscope: Concepts, facteurs et calcul
compte tenu de toutes les théories ci-dessus, il est clair qu’il y a un certain nombre de facteurs à prendre en compte lors du calcul des limites théoriques de résolution. La résolution dépend également de la nature de l’échantillon. Regardons le calcul de la résolution en utilisant la limite de diffraction D’Abbe et en utilisant également le critère de Rayleigh.,
tout d’Abord, il convient de rappeler que:
NA= n x sin α
Où n est l’indice de réfraction du milieu d’imagerie et α est la moitié de l’ouverture angulaire de l’objectif. L’ouverture angulaire maximale d’un objectif est d’environ 144º. Le sinus de la moitié de cet angle est de 0,95. Si vous utilisez un objectif d’immersion avec de l’huile ayant un indice de réfraction de 1,52, le NA maximum de l’objectif sera de 1,45. Si vous utilisez un objectif » sec » (sans immersion), la NA maximale de l’objectif sera de 0,95 (car l’air a un indice de réfraction de 1,0).
la formule de diffraction D’Abbe pour, XY) la résolution est:
d= λ/2 NA
Où λ est la longueur d’onde de la lumière utilisée pour l’image d’un spécimen. Si vous utilisez un feu vert de 514 nm et un objectif d’immersion dans l’huile avec un NA de 1,45, la limite (théorique) de résolution sera de 177 nm.
la formule de diffraction D’Abbe pour la résolution axiale (C’est-à-dire Z) est:
d= 2 λ/NA2
encore une fois, si nous supposons une longueur d’onde de 514 nm pour observer un échantillon avec un objectif de valeur NA de 1,45, alors la résolution axiale sera de 488 nm.
Le critère de Rayleigh est une formule légèrement affinée basée sur les limites de diffraction D’Abbe:
R= 1.,22 λ/NAobj+NAcond
Où λ est la longueur d’onde de la lumière utilisée pour l’image d’un spécimen. NAobj est le NA de l’objectif. NAcond est le NA du condenseur. Le chiffre de ‘1.22’ est une constante. Ceci est dérivé du travail de Rayleigh sur les fonctions de Bessel. Ceux-ci sont utilisés pour calculer des problèmes dans des systèmes tels que la propagation des ondes.
compte tenu de la NA du condenseur, l’air (avec un indice de réfraction de 1,0) est généralement le milieu d’imagerie entre le condenseur et la glissière. En supposant que le condenseur a une ouverture angulaire de 144º, la valeur de la Naconde sera égale à 0,95.,
Si vous utilisez un feu vert de 514 nm, un objectif d’immersion dans l’huile avec un NA de 1,45, un condenseur avec un NA de 0,95, alors la limite (théorique) de résolution sera de 261 nm.
Comme indiqué ci-dessus, plus la longueur d’onde de la lumière utilisée pour l’image d’un échantillon, plus de détails seront réglés. Ainsi, si l’on utilise la plus courte longueur d’onde visible de la lumière de 400 nm, avec un objectif D’immersion dans l’huile avec un NA de 1,45 et un condenseur avec un NA de 0,95, alors R serait égal à 203 nm.,
pour obtenir la résolution maximale (théorique) dans un système de microscope, chacun des composants optiques doit être de la plus haute NA disponible (en tenant compte de l’ouverture angulaire). En outre, l’utilisation d’une longueur d’onde de lumière plus courte pour visualiser le spécimen augmentera la résolution. Enfin, l’ensemble du système de microscope doit être correctement aligné.