A sejtek számlálása
1. ábra szerinti hemocitométerrel. Hemocitométer rácsvonalak.
Hemocytometer diagram jelzi az egyik készlet 16 négyzetek, hogy kell használni a számlálási.
Webinar transcript
a sejtek számlálása lehetővé teszi a sejtszámok pontos meghatározását, ezért a kísérletek közötti konzisztenciát. Ez a videó felvázolja mind a szuszpenzió, mind a tapadási sejtek hemocitométerrel történő számlálásának eljárását.
a munka megkezdése előtt alaposan permetezze be a lamináris áramlásbiztonsági szekrény belsejét fertőtlenítőszerrel,majd törölje le a szövetet., A használt szövetet a megfelelő szemetesbe dobja. Ezután permetezze be a motorháztető belsejét 70% – os etanollal, majd törölje le a szövetet. A motorháztető most tiszta, használatra kész. Távolítsa el a sejttenyészetet és a tripszint a hűtőből, és helyezze nedvesített, 37 fokos C-be, a szén-dioxid inkubátorba, hogy felmelegedjen. Eközben nézze meg a mikroszkóppal megszámolandó sejteket, hogy ellenőrizze a bakteriális és gombás fertőzés vizuális jeleit. A lamináris áramlásbiztonsági szekrényben való lejátszást megelőzően 70% – os etanollal szórja be a közegeket tartalmazó palackokat és pipettákat.,
szuszpenziós cellák esetén óvatosan mozgassa a lombikot, hogy a sejtek jól keveredjenek. Mielőtt esélyt kapnának a leülepedésre, vegyen be egy 0,5 milliliter sejtszuszpenzió-mintát és pipettát egy steril eppendorf csőbe. A tapadási cellákhoz távolítsa el a meglévő közegeket, mossa le szobahőmérsékletű PBS-vel, majd adjon hozzá tripszin EDTA-t a sejtek leválasztásához. Lásd az első táblázatot a szükséges PBS-és tripszin-mennyiségekre vonatkozóan. Inkubáljuk a sejteket két-öt percig a nedvesített 37 ° C-os szén-dioxid inkubátorban. Az inkubációs időt a sejttípusra kell optimalizálni., Amikor az összes sejt leválik, semlegesítse a tripszin EDTA-t meleg szérummal, amely a sejteknek és a tenyészetnek megfelelő növekedési közeget tartalmaz. A szükséges mennyiségeket lásd az első táblázatban.
a cellákat újra felfüggeszti úgy, hogy a sejtszuszpenziót háromszor felfelé és lefelé finoman pipettázza, majd 50 milliliter csőbe juttatja. Centrifugáljuk a sejt szuszpenziót öt percig 1000 fordulat / perc hőmérsékleten szobahőmérsékleten., Steril szerológiai pipettával távolítsa el a felülúszót,majd a sejtpalettát 37 fokos C szérummal, amely növekedési közeget tartalmaz a kiindulási tenyészet eredeti térfogatához. Öt milliliter steril pipettával vegyen be és 0,5 milliliter mintát a sejtszuszpenzióból, majd helyezze át egy steril eppendorf csőbe.
a számláláshoz készítse elő az eldobható hemocitométert. Egy P2000 Gilson pipettával vegyen be 100 mikroliter szuszpenziót, és adjon hozzá 400 mikroliter trypan kék, megjegyzés,.08% és jól keverjük össze., 100 µl a trypan kék sejt szuszpenzió keverjük össze, majd óvatosan pipettával egy csepp a felfüggesztés a kútba, a számolás kamra, amely lehetővé teszi, kapilláris felhívni a minta. Ügyeljen arra, hogy ne töltse túl a számlálási kamrát. Tekintse meg a számlálási területet 10-szeres nagyítás alatt fordított mikroszkóp segítségével. A mikroszkóp segítségével összpontosítson a hemocitométeren lévő négy-négy rács egyikére, és számolja a sejteket negatívra trypan kék esetén. Ezek életképesek. Vegye figyelembe azt is, hogy hány sejt volt pozitív a trypan kék számára., Ezek a sejtek elhaltak, és ez a szám később felhasználható a kultúra százalékos életképességének kiszámításához, ha szükséges.
számláláskor olyan rendszert alkalmaz, amelyben a cellákat csak akkor számolják, ha négyzeten belül vannak, vagy a jobb oldali vagy alsó határvonalon. Jegyezze fel az ebben a 16 négyzetből álló halmazban megszámlált sejtek számát, és mozgassa a hemocitométert addig, amíg a hemocitométeren mind a négy 16 négyzetet meg nem számolják, és azok értékeit rögzítik., A sejtkoncentráció kiszámításához vegye figyelembe az életképes sejtek átlagos számát A négy, 16 négyzetből álló készletben, majd szorozza meg 10 000-rel, hogy milliliterenként megkapja a sejtek számát. Ezután szorozzuk meg ezt ötvel, hogy korrigáljuk a trypan kék hozzáadásával minden ötödik hígítást. Ez a végső érték az életképes sejtek száma milliliterenként az eredeti sejtszuszpenzióban.,
például, ha az életképes sejtszám 200 000 sejt / milliliter 20 ml térfogatban, és 10 000 sejtet szeretne látni az új lombikba, akkor 50 mikrolitert kell átvinni a sejt szuszpenziójából az új lombikba. Helyezze át a szükséges cellaszuszpenziót az új lombikba. Töltsük fel a médiát, és tegyük az inkubátorba.