Conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro
Figura 1. Linee della griglia dell’emocitometro.
Diagramma emocitometro che indica uno degli insiemi di 16 quadrati che dovrebbero essere utilizzati per il conteggio.
Webinar transcript
Il conteggio delle cellule consente la determinazione accurata dei numeri di cellule e, quindi, la coerenza tra gli esperimenti. Questo video illustrerà la procedura per contare sia le cellule di sospensione che quelle di aderenza utilizzando un emocitometro.
Prima di iniziare il lavoro, spruzzare accuratamente l’interno dell’armadio di sicurezza del flusso laminare con disinfettante e pulire con un panno., Smaltire il tessuto usato nell’apposito bidone dei rifiuti. Quindi, spruzzare l’interno della cappa con etanolo al 70% e pulire con il tessuto. La cappa è ora pulita e pronta all’uso. Rimuovere i mezzi di coltura cellulare e la tripsina dal frigorifero e metterli in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi C per riscaldare. Nel frattempo, guarda le cellule da contare usando un microscopio per verificare eventuali segni visivi di contaminazione batterica e fungina. Spruzzare bottiglie e pipette con etanolo al 70% prima di giocare nell’armadio di sicurezza a flusso laminare.,
Per le celle di sospensione, agitare delicatamente il pallone per assicurarsi che le celle siano ben miscelate. Prima di avere la possibilità di stabilirsi, prendere un campione di 0,5 millilitri di sospensione cellulare e pipettare in un tubo eppendorf sterile. Per le cellule di aderenza, rimuovere i supporti esistenti, lavare con PBS a temperatura ambiente e aggiungere tripsina EDTA per staccare le cellule. Fare riferimento alla Tabella Uno per i volumi di PBS e tripsina richiesti. Incubare le cellule per due o cinque minuti nel umidificato 37 gradi C, incubatore di anidride carbonica. Il tempo di incubazione dovrà essere ottimizzato per il tipo di cellula., Quando tutte le cellule sono staccate, neutralizzare la tripsina EDTA con siero caldo contenente mezzi di crescita appropriati alle cellule e alla coltura. Fare riferimento alla Tabella Uno per i volumi richiesti.
Ri-sospendere le celle pipettando delicatamente la sospensione cellulare su e giù per tre volte e trasferirle in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti a 1.000 giri al minuto a temperatura ambiente., Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica sterile e sospendere nuovamente la tavolozza cellulare con siero di 37 gradi C contenente i mezzi di crescita fino al volume originale della coltura iniziale. Utilizzando una pipetta sterile da cinque millilitri, prelevare un campione di sospensione cellulare da 0,5 millilitri e trasferirlo in una provetta sterile di eppendorf.
Per il conteggio, preparare l’emocitometro monouso. Utilizzando una pipetta Gilson P2000, prendere 100 microlitri di sospensione e aggiungere a 400 microlitri di trypan blue, nota,.08% e mescolare bene., Prendere 100 microlitri della miscela di sospensione trypan blue cell e pipettare con cura una goccia della sospensione nel pozzetto della camera di conteggio, consentendo all’azione capillare di aspirare il campione. Fare attenzione a non riempire eccessivamente la camera di conteggio. Visualizzare l’area di conteggio con un ingrandimento 10 volte utilizzando un microscopio invertito. Utilizzando il microscopio, concentrarsi su una delle quattro per quattro griglie sull’emocitometro e contare le cellule in negativo per trypan blue. Questi sono fattibili. Inoltre, prendi nota di quante cellule sono state positive per trypan blue., Queste cellule sono morte e questo numero può essere utilizzato in seguito per calcolare la percentuale di vitalità della coltura, se necessario.
Quando si conta, utilizzare un sistema in cui le celle vengono contate solo quando si trovano all’interno di un quadrato, o sulla mano destra o sulla linea di confine inferiore. Registra il numero di celle contate in questo set di 16 quadrati e sposta l’emocitometro fino a quando tutte e quattro le serie di 16 quadrati sull’emocitometro sono state contate e i loro valori registrati., Per calcolare la concentrazione cellulare, prendere il numero medio di cellule vitali nei quattro gruppi di 16 quadrati e moltiplicare per 10.000 per ottenere il numero di cellule per millilitro. Quindi, moltiplicalo per cinque per correggere la diluizione di uno su cinque dall’aggiunta blu di tripano. Questo valore finale è il numero di cellule vitali per millilitro nella sospensione cellulare originale.,
Ad esempio, se il numero di cellule vitali è di 200.000 cellule per millilitro in un volume di 20 millilitri e si desidera vedere 10.000 cellule nel nuovo pallone, è necessario trasferire 50 microlitri della sospensione cellulare nel nuovo pallone. Trasferire il volume richiesto di sospensione cellulare nel nuovo pallone. Rabboccare con i media e mettere nell’incubatrice.