di metodi per l’identificazione di stafilococchi coagulasi-negativi
CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA
il Confronto di metodi per l’identificazione di stafilococchi coagulasi-negativi
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu SP, Brasil
ABSTRACT
stafilococchi Coagulasi-negativi (CNS) l’identificazione delle specie è ancora difficile per la maggior parte dei laboratori clinici., Lo schema proposto da Kloos e Schleifer e modificato da Bannerman è il metodo di riferimento utilizzato per l’identificazione di specie e sottospecie stafilococciche; tuttavia, questo metodo è relativamente laborioso per l’uso di routine poiché richiede l’utilizzo di un gran numero di test biochimici. L’obiettivo del presente studio era quello di confrontare quattro metodi, cioè il metodo di riferimento, il sistema API Staph (bioMérieux) e due metodi modificati dal metodo di riferimento nel nostro laboratorio (metodo semplificato e metodo del disco), nell’identificazione di 100 ceppi del SNC., Rispetto al metodo di riferimento, il metodo semplificato e il metodo del disco hanno identificato correttamente rispettivamente il 100 e il 99% delle specie del SNC, mentre questo tasso era dell ‘ 84% per il sistema stafilococco API. Per Staphylococcus epidermidis (2,2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37,5%) e S. warneri (47,1%) è stata osservata un’identificazione imprecisa mediante il metodo API Staphylococcus., Il metodo semplificato che utilizza lo schema di identificazione semplice proposto nel presente studio è risultato efficace per tutti i ceppi testati, con sensibilità e specificità al 100% e si è rivelato un’alternativa disponibile per l’identificazione degli stafilococchi, offrendo maggiore affidabilità e costi inferiori rispetto ai sistemi commerciali attualmente disponibili. Questo metodo sarebbe molto utile nel laboratorio di microbiologia clinica, specialmente in luoghi con risorse limitate.,
Parole chiave: stafilococchi coagulasi-negativi-metodi-identificazione-API Staphylococcus
Finora sono state identificate quaranta specie del genere Staphylococcus (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, un coagulasi-positivi specie che produce una serie di altri enzimi e tossine, è il più noto ed è stato frequentemente implicati nell’eziologia di una serie di infezioni e intossicazioni nell’uomo e negli animali, mentre stafilococchi coagulasi-negativi (CNS), che rappresentano la maggior parte delle specie, sono stati considerati per essere saprofiti o raramente patogeni (Kloos & Schleifer 1975)., Nell’ultimo decennio, tuttavia, il SNC è stato riconosciuto come gli agenti eziologici di una serie di processi infettivi, che rappresentano i microrganismi più comunemente isolati dalle emocolture (Huebner & Goldmann 1999).
Circa la metà delle specie del SNC colonizza naturalmente l’uomo, e attualmente sono considerati agenti eziologici essenzialmente opportunistici, che prevalgono in numerose situazioni organiche per produrre infezioni gravi (Bannerman 2003)., L’emergere del SNC come agenti patogeni di diverse infezioni può essere il risultato del crescente uso di procedure invasive come cateteri intravascolari e protesi in pazienti sottoposti a trattamento intensivo, pazienti immunocompromessi, bambini prematuri, pazienti con neoplasie e pazienti trapiantati (Kloos & Bannerman 1994).
Le specie che più frequentemente causano malattie nell’uomo sono S., epidermidis (batteriemia, infezioni dovute a dispositivi medici impiantati come protesi e cateteri, infezione di ferite chirurgiche, peritonite in pazienti in dialisi peritoneale continua, osteomielite, endoftalmite ecc.), S. haemolyticus (endocardite, peritonite, setticemia e infezioni del tratto urinario, ferite, ossa e articolazioni) e S. saprophyticus (infezioni urinarie e processi setticemici). Altri patogeni opportunisti significativi includono S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus e S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis sembra essere associato a endocardite dopo l’impianto di valvole protesiche, con peritonite, con infezione dei tessuti molli e con osteomielite vertebrale (Osmon et al. 2000).
In considerazione del noto potenziale patogeno del SNC all’interno dell’ambiente ospedaliero, l’interesse per la varietà di specie correlate all’infezione e il loro potenziale tossigenico e virulenza è aumentato nell’ultimo decennio e ha portato alla pubblicazione di vari studi su questi aspetti., Tuttavia, nonostante la crescente caratterizzazione delle infezioni del SNC, questi microrganismi non sono identificati nei laboratori di microbiologia clinica. Lo schema proposto da Kloos e Schleifer (1975) e modificato da Bannerman (2003) è il metodo usato convenzionalmente; tuttavia, questo metodo è relativamente laborioso per l’uso di routine poiché è richiesto un gran numero di test biochimici., Nella maggior parte dei laboratori di routine, gli stafilococchi sono identificati in base agli aspetti morfologici delle colonie, alla colorazione di gram e alla produzione di catalasi e coagulasi, che consentono solo la classificazione degli stafilococchi in isolati di S. aureus e non-S. aureus, con questi ultimi semplicemente classificati come CNS.
Lo sviluppo di metodi per l’identificazione di specie e sottospecie stafilococciche consente ai medici di ottenere informazioni sulla varietà di SNC presente nei campioni clinici e di considerarli come agenti eziologici dei processi infettivi., È necessaria un’accurata identificazione del SNC per avere una previsione precoce della potenziale patogenicità o suscettibilità agli antibiotici di ciascun isolato clinico e per chiarire il significato clinico di ciascuna specie. Gli isolati ripetuti del SNC dai pazienti con le malattie invasive dovrebbero essere identificati per permettere un confronto dei ceppi. D’altra parte, l’identificazione delle specie è un prerequisito prima che vengano intraprese procedure di tipizzazione per gli studi epidemiologici.,
Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi sistemi commerciali per l’identificazione rapida degli stafilococchi come alternativa ai classici protocolli di identificazione (Bannerman 2003). Tuttavia, questi sistemi diagnostici presentano problemi come il costo e il tempo di incubazione, spesso forniscono risultati inaffidabili (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Inoltre, molti di questi kit sono stati progettati per l’identificazione di tutte le specie note del SNC (cioè isolati clinici, veterinari e alimentari) e quindi non sono molto specifici., Sulla base delle considerazioni riportate, in vista della necessità di una rapida, semplice ed affidabile, metodi, l’obiettivo del presente studio era di confrontare le tecniche, per l’identificazione del sistema nervoso centrale, cioè, un metodo di riferimento (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman, 2003), il commerciale API Staph sistema, e due metodi modificato dal metodo di riferimento nel nostro laboratorio per sviluppare alternative dei metodi di identificazione combinazione di semplicità, affidabilità e basso costo, specialmente con risorse limitate.,
MATERIALI E METODI
Isolati – Sono stati studiati un centinaio di isolati del SNC ottenuti da campioni clinici di pazienti ospedalizzati presso l’Ospedale universitario della Facoltà di Medicina, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu Campus. I ceppi sono stati isolati come descritto da Koneman et al. (1997).
Identificazione del SNC – Gli isolati ottenuti da campioni clinici sono stati placcati su agar ematici e gram colorati per garantirne la purezza e la conservazione della loro morfologia e colorazione specifica., Dopo la conferma di queste caratteristiche, gli isolati sono stati sottoposti ai test di catalasi e coagulasi. Lo stafilococco è stato differenziato dalle specie Micrococcus sulla base dell’ossidazione e della fermentazione del glucosio, della resistenza alla bacitracina (0,04 U) indicata dall’assenza di un alone di inibizione o dalla presenza di un alone di inibizione fino a 9 mm di diametro e dalla suscettibilità al furazolidone (100 µg) caratterizzata da zone di inibizione di diametro compreso tra 15 e 35 mm (Baker 1984).
I quattro metodi descritti di seguito sono stati utilizzati per l’identificazione del SNC., I seguenti ceppi del SNC di riferimento internazionale sono stati utilizzati come controlli: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979) e S. saprophyticus (ATCC 15305).,
metodo di Riferimento proposto da Kloos e Schleifer (1975) e Bannerman (2003) – Questo metodo consiste in una serie di test biochimici che determinano l’utilizzo di zuccheri, xilosio, arabinosio, saccarosio, trealosio, il maltosio, il mannitolo, lattosio, xilitolo, ribosio, fruttosio, mannosio, la produzione di emolisina, la riduzione dei nitrati, la presenza di ureasi e ornitina decarbossilasi, e la resistenza di novobiocina caratterizzata da un alone di inibizione fino a 16 mm. Letture dei test sono stati ottenuti dopo 24, 48 e 72 h di incubazione a 37 ° C in un incubatore.,
API Staph-Il sistema API Staph (bioMérieux) è una batteria di test pronta all’uso composta da 20 test biochimici a cui viene aggiunta una sospensione batterica omogenea a 0,5 McFarland torbidità. Dopo 24 ore di incubazione a 37ºC e aggiunta dei reagenti VP (VP1 e VP2), NIT (NIT1 e NIT2) e PAL (ZYM A e ZYM B) che accompagnano il kit, le reazioni sono state interpretate e i microrganismi sono stati identificati utilizzando il catalogo analitico., L’identificazione si basa su un sistema numerico composto da sette cifre che fornisce l’identificazione percentuale (%ID), con un valore > 80% accettabile.
Metodi modificati-Sono stati utilizzati due metodi di identificazione modificati nel nostro laboratorio (metodo semplificato e metodo del disco). Il metodo semplificato è stato diviso in due fasi. Durante la prima fase sono state testate la fermentazione di xilosio, saccarosio, trealosio, maltosio e mannitolo, la produzione di emolisina e la crescita anaerobica del tioglicolato (Tabella I)., I test utilizzati nella seconda fase variavano in base ai risultati ottenuti nella prima fase di identificazione dopo incubazione di 72 ore a 37ºC. Il test complementari utilizzati durante il secondo passaggio (quando necessario) sono riportati nella Tabella II.
Il metodo del disco è articolato nelle seguenti prove: fermentazione di arabinosio, saccarosio, trealosio, maltosio e lattosio, mannitolo, la riduzione dei nitrati, la produzione di emolisina test dell’ureasi e ornitina decarbossilasi, e la resistenza di novobiocina., Per il test di fermentazione dello zucchero, i dischi disponibili in commercio specifici per ogni zucchero sono stati posti in provette contenenti 2,5 ml di mezzo base di brodo viola. Le sospensioni batteriche sono state inoculate come descritto da Kloos e Schleifer (1975). Le letture per i due metodi sono state ottenute dopo 24, 48 e 72 h di incubazione a 37ºC e le specie del SNC sono state identificate secondo lo schema di identificazione proposto nella figura.,
l’analisi Statistica Per determinare il grado di accordo tra i metodi utilizzati per l’identificazione del sistema nervoso centrale (metodo semplificato, il metodo del disco e API Staph) e il metodo di riferimento (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman, 2003), la sensibilità e la specificità del test (Sox 1986) sono stati valutati come segue.,
Sensibilità: percentuale di ceppi del SNC che sono risultati positivi per una determinata specie con il metodo di riferimento e che sono stati identificati come la stessa specie con il metodo analizzato (metodo semplificato, disco o API Stafilococco).
Specificità: percentuale di ceppi del SNC che sono risultati negativi per una determinata specie con il metodo di riferimento e che sono risultati negativi anche per la stessa specie quando sono stati testati con il metodo analizzato (metodo semplificato, disco o stafilococco API).
RISULTATI
I 100 isolati stafilococcici sono stati testati con i quattro metodi proposti., I risultati ottenuti con il metodo di riferimento (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) sono stati confrontati con quelli ottenuti con i metodi modificati e il sistema API Staph.
La tabella III mostra l’accordo nell’identificazione tra i saggi analizzati e il metodo di riferimento. Il metodo semplificato e il metodo del disco hanno mostrato una positività del 100 e del 99% rispetto al metodo di riferimento, mentre questa percentuale era dell ‘ 84% per il sistema API Staph. Dei 16 isolati con disaccordo di identificazione con il metodo API Stafilococco, 10 (62.,5%) ha mostrato una corretta identificazione ma con un % ID dal 7,1 al 31%, inferiore al valore accettabile.
Il metodo semplificato effettuato in due fasi non differiva dal metodo di riferimento in termini di identificazione delle specie del SNC. A differenza degli altri metodi, il metodo del disco ha mostrato un’identificazione imprecisa e ha identificato erroneamente un ceppo S. hominis (6,5%) a causa della non fermentazione del saccarosio sul disco, portando alla classificazione di questo ceppo come S. caprae. Non è stata osservata alcuna incongruenza per le altre specie.,
La più grande differenza è stata osservata tra il metodo di riferimento e le API Staph sistema, con il secondo metodo non identificare con precisione 1 S. epidermidis ceppo (identificato come S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus ceppi (2 identificato come S. aureus e 1 a S. hominis), 4 S. hominis ceppi (2 identificato come S. lugdunensis, 1 a S. haemolyticus e 1 come S. aureus), e 8 S. warneri ceppo (3 identificato come S. lugdunensis, 2 S. haemolyticus 2 S. hominis e 1 a S. saprophyticus) (Tabella III).,
DISCUSSIONE
CNS sono i microrganismi più comunemente isolati da emocolture, che rappresentano un grave problema di salute in molti paesi in via di sviluppo e anche sviluppato (Renneberg et al. 1995). Alcuni studi hanno suggerito un’associazione tra S. epidermidis e infezioni nosocomiali (Vuong & Otto 2002) con questa specie identificata nel 74-92% dei pazienti con batteriemie causate dal SNC (Martin et al. 1989). Tuttavia, altri studi hanno riportato una serie di infezioni causate da altre specie del SNC (Herwaldt et al. 1996), principalmente S., haemolyticus che è la seconda specie più frequentemente rilevata (Bannerman 2003). Poiché SNC sono gli agenti eziologici di una serie di processi infettivi, l’identificazione di questi microrganismi è importante per la determinazione delle loro caratteristiche fisiopatologiche e cliniche importanza e per studi epidemiologici, e ha portato alla pubblicazione di diversi studi analizzando i metodi di identificazione per questi batteri (Knapp & Washington 1989, Bannerman, et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, De Paulis et al. 2003).,
Nel presente studio, i metodi modificati nel nostro laboratorio hanno dato buoni risultati in termini di corretta classificazione delle specie del SNC rispetto al metodo di riferimento, con un accordo del 100% per il metodo semplificato modificato e un accordo del 99% per il metodo del disco.
Il metodo semplificato mediante l’identificazione schema qui proposto (Figura) ha portato all’identificazione di S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis, e S. simulans in un unico passaggio, con un totale di sette prove biochimiche, un numero inferiore rispetto a quello impiegato nel metodo di riferimento (16 test)., Poiché S. epidermidis è la specie più frequentemente isolata, il 70-90% dei ceppi (Bannerman 2003) isolati in laboratorio clinico può essere identificato utilizzando un numero ridotto di test.
Per quanto riguarda il tempo di incubazione, i risultati hanno mostrato che il 91% dei ceppi analizzati nello studio fermentava lo zucchero specie-specifico entro 48 h di incubazione a 37ºC., Gli altri ceppi (9%) sono risultati positivi alla fermentazione di determinati zuccheri dopo 72 ore di incubazione, dimostrando l’importanza di un’incubazione dei test di fermentazione dello zucchero di almeno 72 ore al fine di identificare correttamente questi microrganismi.
L’identificazione delle sottospecie di S. cohnii, S. schleiferi schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus e S. lugdunensis ha richiesto l’esecuzione di due o tre test biochimici aggiuntivi, denominati seconda fase, che variavano in base al risultato ottenuto nella prima fase del metodo semplificato., Tuttavia, 20 ceppi (37,7%) che hanno richiesto la seconda fase per la loro identificazione hanno fermentato il trealosio entro 24 ore, consentendo così il proseguimento preliminare dei test aggiuntivi. Più tempo è necessario per identificare la S. cohnii, S. schleiferi sottospecie schleiferi, e S. caprae, dal momento che il secondo passo necessario per l’identificazione di queste specie, inclusa la riduzione dei nitrati test il cui risultato è disponibile solo dopo 48 h. Tuttavia, questo fatto non comporta un ritardo nella diagnosi del sistema nervoso centrale dal momento che la frequenza di queste specie in campioni clinici è bassa.,
Il metodo del disco è risultato anche altamente efficiente e pratico in quanto non richiede una precedente preparazione di zuccheri, prevenendo così la perdita di terreni di coltura, oltre a raggiungere un elevato accordo nell’identificazione del SNC con il metodo di riferimento.
Il kit di stafilococco API commerciale ha mostrato la più bassa precisione nell’identificazione del SNC tra i metodi studiati (accordo 84%), in accordo con gli studi di (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995).
S. warneri e S. hominis erano le specie più difficili da identificare. Bannerman et al., (1993) ha anche riportato una minore precisione nell’identificazione di queste specie. Nello studio di Ieven et al. (1995), S. hominis è stato identificato con la minima precisione dal sistema di stafilococco API ID 32. Questa scoperta potrebbe essere spiegata dalla mancanza di test complementari come la resistenza alla novobiocina, la crescita anaerobica del tioglicolato e la produzione di emolisina.
Nel caso di S., haemolyticus, un’errata identificazione da parte del sistema stafilattico API potrebbe essere spiegata dal fatto che il kit non suggerisce la produzione di emolisina come test complementare, che sarebbe essenziale per l’identificazione dei ceppi di S. haemolyticus.
Tre (3%) dei 100 ceppi analizzati dal sistema di stafilococco API sono stati identificati come S. aureus, un fatto riportato anche da Renneberg et al. (1995). Il kit è risultato inefficiente in questi casi poiché non richiedeva il risultato del test fondamentale e più ampiamente accettato per l’identificazione di S. aureus, cioè,, il test della coagulasi (Koneman et al. 1997).
Secondo Piccolomini et al. (1994), il basso accordo tra lo stafilococco API e il tradizionale test biochimico per l’identificazione del SNC può essere spiegato con l’uso di diversi tempi di incubazione, concentrazioni di substrato e/o marcatori di sensibilità.,
In conclusione, i due metodi modificati nel nostro laboratorio sono risultati altamente efficienti per l’uso di routine a causa della loro elevata sensibilità e specificità rispetto al metodo di riferimento, oltre a richiedere meno test e quindi essere più economici e più veloci del metodo standard. Nonostante richieda un tempo di incubazione più breve (18 h), il sistema di stafilococco API ha mostrato una sensibilità inferiore nell’identificazione di alcune specie., Indubbiamente, l’identificazione delle specie del SNC sarà facilitata e incoraggiata dalla disponibilità di una procedura semplice, economica e accurata, specialmente in luoghi con risorse limitate.
RINGRAZIAMENTI
A bioMérieux per la donazione dei kit di stafilococco API utilizzati nel presente studio.
Baker JS 1984. Confronto di vari metodi per la differenziazione di stafilococchi e micrococci. J Clin Microbiol 19: 875-879.
Bannerman TL 2003. Staphylococcus, Micrococcus e altri cocchi catalasi-positivi che crescono aerobicamente., In PR Murray, EJ Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller, RH Yolken( eds), Manuale di microbiologia clinica, American Society Microbiology, Washington, p. 384-404.
Bannerman TL, Kleeman KT, Kloos WE 1993. Valutazione della carta di identificazione Gram-positiva dei sistemi Vitek per l’identificazione di specie di stafilococchi coagulasi-negativi. J Clin Microbiol 31: 1322-1325.
De Paulis AN, Predari S, Chazarreta CD, Santoianni JE 2003. Schema semplice a cinque test per l’identificazione a livello di specie di stafilococchi coagulasi-negativi clinicamente significativi. J Clin Microbiol 41: 1219-1224.,
Grant CE, Sewell DL, Pfaller M, Bumgardner RVS, Willians JA 1994. Valutazione di due sistemi commerciali per l’identificazione dello stafilococco coagulasi-negativo a livello di specie. Diag Microbiol Infettare Dis 18: 1-5.
Herwaldt LA, Geiss M, Kao C, Pfaller M 1996. Il valore positivo di isolare gli stafilococchi coagulasi-negativi dalle emocolture. Clin Infettare Dis 22: 14-20.
Huebner J, Goldmann DA 1999. Stafilococchi coagulasi-negativi: ruolo come agenti patogeni. Annu Rev Med 50: 223-236.
Ieven M, Verhoeven J, Pattyn SR, Goossens H 1995., Metodo rapido ed economico per l’identificazione delle specie di stafilococchi coagulasi-negativi clinicamente significativi. J Clin Microbiol 33: 1060-1063.
Kloos WE, Bannerman TL 1994. Aggiornamento sul significato clinico degli stafilococchi coagulasi-negativi. Clin Microbiol Rev 7: 117-140.
Kloos WE, Schleifer KH 1975. Schema semplificato per l’identificazione di routine delle specie di stafilococco umano. J Clin Microbiol 1: 82-88.
Knapp CC, Washington JA 1989., Valutazione del brodo di trealosio-mannitolo per la differenziazione di Staphylococcus epidermidis da altre specie stafilococciche coagulasi-negative. J Clin Microbiol 27: 2624-2626.
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC 1997. Atlante di colore e libro di testo di Microbiologia diagnostica, 5th ed., Lippincott, Philadelphia, 1395 pp.
Kwok AYC, Chow AW 2003. Studio filogenetico delle specie Staphylococcus e Macrococcus basato su sequenze parziali del gene hsp60. Int J Syst Evol Microbiol 53: 87-92.
Martin MA, Pfaller MA, Wenzel RP 1989., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern Med 110: 9-16.
Osmon DR, Sampathkumar P, Cockerill FR 2000. Prosthetic joint infection due to Staphylococcus lugdunensis. Mayo Clinic Proceedings 75: 511-512.
Perl TM, Rhomberg PR, Bale MJ, Fuchs PC, Jones RN, Koontz FP, Pfaller MA 1994. Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diag Microbiol Infect Dis 18: 151-155.
Piccolomini R, Catamo G, Picciani C, D”Antonio D 1994., Valutazione del sistema stafilococco 18-R per l’identificazione di isolati clinici stafilococcici a livello di specie. J Clin Microbiol 32: 649-653.
Renneberg J, Rieneck K, Gutschik E 1995. Valutazione del sistema Stafilococco ID e del sistema Stafilococco Zym per l’identificazione di stafilococchi coagulasi-negativi. J Clin Microbiol 33: 1150-1153.
Sox HC 1986. Teoria della probabilità nell’uso di test diagnostici. Introduzione allo studio critico della letteratura. Ann Med Stagista 104: 60-66.
Trülzsch K, Rinder H, Trèek J, Bader L, Wilhelm U, Heesemann J 2002., “Staphylococcus pettenkoferi”, a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diag Microbiol Infect Dis 43: 175-182.
Vuong C, Otto M 2002. Staphylococcus epidermidis infections. Microb Infect 4: 481-489.