Effetti del dimetilaminoetanolo e dell’amminoacido composto sul modello di invecchiamento cutaneo indotto dal D-galattosio del ratto

Abstract

Un sogno duraturo degli esseri umani è quello di invertire o posticipare l’invecchiamento. In questo studio, il dimetilaminoetanolo (DMAE) e l’aminoacido composto (AA) in mesoterapia sono stati studiati per i loro potenziali effetti antiaging sulla pelle indotta dall’invecchiamento del D-galattosio. A 18 giorni dall’induzione del D-gal, ciascun ratto è stato trattato con microiniezione intradermica di soluzione salina, AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA o 0,2% DMAE + AA, rispettivamente., A 42 giorni dopo il trattamento, la ferita cutanea è stata raccolta e dosata. La misurazione dello spessore epidermico e dermico nei gruppi 0.1% DMAE + AA e 0.2% DMAE + AA è apparsa significativamente più spessa dei ratti di controllo dell’invecchiamento. Non sono state riscontrate differenze nel contenuto di acqua tissutale tra i gruppi. L’idrossiprolina nello 0,1% DMAE + AA, nello 0,2% DMAE + AA e nei gruppi di controllo sham era molto più alta di tutti gli altri gruppi. L’espressione di collagene di tipo I, di tipo III e MMP-1 è stata altamente sovraregolata in entrambi i gruppi DMAE + AA 0.1% e DMAE + AA 0.2% rispetto al controllo dell’invecchiamento., Al contrario, i livelli di espressione TIMP-1 di vari gruppi di invecchiamento sono stati significativamente ridotti rispetto al controllo fittizio. La coiniezione di DMAE e AA nel tessuto dell’obiettivo ha marcato gli effetti antiaging sul modello di invecchiamento cutaneo indotto D-galattosio del ratto.

1. Introduzione

L’antiaging è un tema eterno e un sogno dell’essere umano., I cambiamenti della pelle legati all’età sono inevitabili e includono assottigliamento, cedimenti, rughe, perdita di elasticità, aree di secchezza e un turnover inverso del rapporto collagene di tipo I/III nella pelle che si presentava come ridotta sintesi del collagene di tipo I ma produzione sovraregolata di collagene di tipo III . Attualmente la mesoterapia sta suscitando l’interesse di tutti come strategia antiaging., È una procedura minimamente invasiva, che consiste nella microiniezione intradermica di sostanze farmacologiche, come nutrienti, ormoni, vitamine, enzimi e altri reagenti, che sono stati diluiti e vengono somministrati direttamente nella regione da trattare. Sotto manipolazione sterile e professionale, Mesoterapia è molto raramente causando problemi di infezione della pelle e necrosi, tranne alcuni rischi minori come gonfiore e dolore durante l’iniezione., Come una procedura sicura, semplice, meno dolorosa che è una delle cosiddette “procedure cosmetiche all’ora di pranzo”, non richiede tempo di recupero ed è perfetta per i professionisti e le persone di successo nella vita moderna frenetica .

Dimethylaminoethanol (DMAE), un analogo della colina della vitamina di B e un precursore di acetilcolina, sta ricevendo più attenzione come nuovo supplemento emozionante di cura della pelle oggi per i suoi effetti acuti di antiaging, di antiwrinkle e di fermezza della pelle. DMAE è ben noto per l’uso in applicazioni esterne., Negli studi clinici randomizzati, 3% DMAE facial gel ha dimostrato di essere sicuro ed efficace nella mitigazione delle linee della fronte e delle rughe sottili periorbitali e nel migliorare la pienezza e la forma delle labbra e l’aspetto generale della pelle del viso . Un’estensione in aperto dello studio ha anche mostrato che l’applicazione a lungo termine di DMAE gel fino a 1 anno era associata a un buon profilo di sicurezza ., Tuttavia, il trattamento tropicale con DMAE richiede solitamente l’alta dose e la concentrazione per passare attraverso la barriera epidermica di permeabilità, che potrebbe incorrere nelle preoccupazioni della sua tossicità, degli effetti collaterali e dei costi medici. È stato riportato che 2,5–10 mmol/mL DMAE potrebbero causare una citopatologia vacuolare di cellule umane di fibroblasti coltivate in vitro. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che l’applicazione del gel DMAE al 3% tropicamente potrebbe anche comportare la citopatologia vacuolare delle cellule epidermiche dell’orecchio di coniglio. È necessaria una somministrazione alternativa di DMAE per valutare l’efficacia relativa per il miglioramento dell’invecchiamento cutaneo.,

Al fine di valutare i potenziali effetti antiaging di DMAE a basse dosi somministrati per via intradermica mediante microiniezione localizzata (mesoterapia), in questo studio sono stati misurati la struttura tissutale e il metabolismo del collagene della pelle indotta da D-gal. Nel frattempo, è stata studiata anche la coiniezione dell’amminoacido composto (AA), che porta ad una ridotta tossicità cellulare mediante iniezione DMAE e ad essere un apporto nutrizionale locale. È stato anche descritto il loro meccanismo d’azione considerato nella pelle.

2. Materiali e metodi

2.1., Animali

I ratti maschi di Wistar sono stati acquistati dall’Istituto di Scienze farmaceutiche (Qingdao, Cina). Tutti gli animali pesavano 180-220 g al momento dell’intervento chirurgico. La cura degli animali e il protocollo sperimentale sono stati approvati dall’ospedale affiliato del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Scuola medica dell’Università di Qingdao.

Totale 80 ratti Wistar sono stati suddivisi casualmente in ciascun gruppo sperimentale (come dettagliato nella Tabella 1)., Agli animali di ciascun gruppo di trattamento, ad eccezione del gruppo di controllo fittizio, è stata somministrata iniezione sottocutanea di D-galattosio (D-gal) alla dose di 125 mg/kg·d per 6 settimane per indurre il modello di invecchiamento cutaneo del ratto. A 18 giorni dall’iniezione di D-gal, ciascun ratto è stato anestetizzato con idrato di cloralio (0,25 mL per 100 g di peso corporeo) e disinfettato all’interno dell’area dell’anca. Un’area di tatuaggio rotonda di 3 cm è stata prefabbricata su ciascun lato dell’anca del ratto e quindi trattata in anestesia generale una volta alla settimana per 4 settimane con microiniezione intradermica di soluzione salina (NS), AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA o 0.,2% DMAE + AA, rispettivamente. Sia il controllo negativo dell’invecchiamento che i gruppi di controllo fittizi hanno ricevuto esattamente la stessa procedura chirurgica ma senza alcun trattamento in studio. A 42 giorni dal trattamento, tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia e le ferite cutanee sono state confrontate mediante istologia, misurazione del contenuto di acqua, contenuto di idrossiprolina e test quantitativi di PCR in tempo reale.

2.2. Istopatologia

Lo spessore della pelle è stato misurato con il software di analisi delle immagini SimplePCI (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) in sezioni colorate con ematossilina ed eosina., Lo spessore epidermico è stato misurato dalla superficie dello strato corneo (SC) al fondo delle papille dermiche, mentre lo spessore dermico è stato misurato dalla parte superiore delle papille alle porzioni più profonde del derma reticolare fino a raggiungere il tessuto adiposo o il muscolo. Sotto lo stesso ingrandimento, 5 singole posizioni sono state selezionate casualmente per misurare lo spessore della pelle da ciascuno dei 5 campi di vista per sezione. Con la macchia tricromatica di Masson di tutte le sezioni, sono stati scelti a caso 5 diversi campi visivi e analizzati per la densità della fibra di collagene.

2.3., Misurazione del contenuto di acqua

1 cm2 di ferita cutanea è stata raccolta e misurata per la precisa pesatura a umido, seguita da cottura a 80°C per 12 ore prima di misurare il suo peso a secco. Il contenuto di acqua della pelle è stato calcolato dalla formula della percentuale di contenuto di acqua = ((peso umido − peso secco) ÷ peso umido) × 100%.

2.4. La misurazione del contenuto di idrossiprolina

Il contenuto di idrossiprolina nella ferita cutanea è stato misurato secondo il protocollo di fabbricazione dei kit di analisi commerciali (NANJING JIANCHEN biological engineering Co., LTD, Nanchino, Cina).

2.5., Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

Le ferite cutanee sono state omogeneizzate in TRIzol1 (Invitrogen) e l’RNA totale è stato estratto secondo il protocollo del produttore. 1 µg di RNA totale è stato trascritto in modo inverso in cDNA utilizzando il sistema di sintesi RT PrimeScript (Takara Biotechnology/Takara Bio, Dalian, Cina). Un metodo PCR quantitativo altamente sensibile è stato eseguito con questi prodotti cDNA. Tutti i primer e le sonde personalizzati sono stati convalidati per la loro efficienza (come mostrato nella Tabella 2)., La miscela di reazione da 10 ml conteneva 2x Power SYBR1 Green PCR Master Mix, cDNA diluito 10 volte e 0,2 mm di ciascun primer. Termica protocollo consisteva in 10 min polimerasi attivazione a 95°C, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95°C per 30 s, primer ricottura a 55°C per 1 min, e l’estensione a 72°C per 30 s. I livelli di espressione di mRNA sono stati normalizzati a quelli endogeni gene di riferimento β-azione e presentato come piegare le modifiche a quelli ottenuti dall’invecchiamento di controllo di campioni di pelle.,

2.6. Statistical Analysis

Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., I risultati sono stati considerati statisticamente significativi ad un livello di probabilità di .

3. Risultati

3.1. Cambiamenti istologici

L’invecchiamento della pelle ha mostrato una diminuzione dello spessore sia per l’epidermide che per il derma rispetto ai ratti di controllo fittizi. Con l’invecchiamento, l’epidermide ha ridotto il numero di strati cellulari e le fibre di collagene dermico sono diventate sparse, sottili o rotte. Rispetto al controllo dell’invecchiamento, tuttavia, questi cambiamenti istologici sono stati notevolmente migliorati nei gruppi 0.1% DMAE + AA, 0.2% DMAE + AA e 0.2% DMAE (Figure 1 (a) -1 (h)).

Quando trattato con 0,1% DMAE + AA o 0.,2% DMAE + AA, sia lo spessore epidermico che dermico e la densità della fibra di collagene sono stati significativamente elevati rispetto a quelli del gruppo di controllo dell’invecchiamento. Inoltre, lo 0,2% di DMAE da solo ha anche aumentato significativamente lo spessore epidermico e la densità della fibra di collagene rispetto al controllo dell’invecchiamento. Tuttavia, questi tre parametri in tutti i gruppi di invecchiamento sono stati notevolmente ridotti rispetto a quelli del gruppo di controllo sham(Figure 2(a), 2(b) e 2 (c)).

3.2. Contenuto di acqua nell’invecchiamento della pelle

Non ci sono state differenze statisticamente significative nel contenuto di acqua tra tutti i gruppi (Figura 2(d)).,

3.3. Contenuto di idrossiprolina nell’invecchiamento della pelle

Il contenuto di idrossiprolina è stato notevolmente aumentato nell’invecchiamento della pelle trattata sia con il complesso DMAE + AA 0.1% che con il complesso DMAE + AA 0.2%, che ha mostrato differenze significative rispetto a tutti gli altri gruppi di invecchiamento. È interessante notare che il contenuto di idrossiprolina nel gruppo DMAE + AA 0.2% ha raggiunto un livello equivalente a quello del controllo sham ma era significativamente più alto di tutti gli altri 6 gruppi di invecchiamento. Non vi è stata alcuna differenza significativa tra i gruppi DMAE + AA dello 0,1% e DMAE + AA dello 0,2% (Figura 2(e)).

3.4., L’espressione di mRNA di tipo I, procollagene di tipo III, MMP-1 e TIMP-1 Geni bersaglio

L’espressione di collagene di tipo I è stata notevolmente sovraregolata in risposta a trattamenti DMAE + AA allo 0,1% e DMAE + AA allo 0,2%, che non hanno mostrato alcuna differenza significativa rispetto a quella del controllo fittizio. Tuttavia, uno qualsiasi degli altri gruppi di invecchiamento ha mostrato molto meno espressione di collagene di tipo I rispetto ai ratti di controllo fittizi (Figura 3(a)). Quando trattati con 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA o 0.,2% DMAE da solo, i livelli di trascrizione per il collagene di tipo III erano considerevolmente elevati rispetto al gruppo di controllo dell’invecchiamento, ma significativamente inferiori al controllo fittizio (Figura 3(b)). Come potenziale regolatore chiave nell’invecchiamento cutaneo, i messaggi MMP-1 sono aumentati in risposta al trattamento DMAE + AA 0.1% o DMAE + AA 0.2%, che ha mostrato una differenza statisticamente significativa da quella del controllo dell’invecchiamento, ma non dei ratti di controllo fittizio (Figura 3(c)). Al contrario, i livelli di trascrizione per TIMP-1 in tutti i gruppi di invecchiamento sono stati significativamente ridotti a un livello molto più basso di quello del controllo fittizio (Figura 3(d)).,

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 3

Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., La ferita cutanea è stata elaborata e analizzata per l’espressione del collagene di tipo I (a), del collagene di tipo III (b), MMP-1 (c) e del suo inibitore e TIMP-1 (d) mediante RT-PCR quantitativo. I livelli di espressione per ciascun gene di targeting sono stati normalizzati al gene di riferimento endogeno e riportati come valori relativi (ΔΔCt) a quelli ottenuti dal gruppo di controllo dell’invecchiamento. e † indicano una differenza significativa () rispetto al controllo negativo (gruppo 1) e al controllo fittizio (gruppo 8), rispettivamente.

4., Discussione

L’iniezione di D-galattosio a basse dosi nella pelle del ratto potrebbe indurre cambiamenti che assomigliano all’invecchiamento accelerato. Nei nostri studi, il modello di invecchiamento del ratto ha mostrato cambiamenti di colore dei capelli, diminuzione delle attività e compromissione neurologica. I cambiamenti istologici della pelle indotta da invecchiamento D-gal si sono presentati come epidermide più sottile con strati di cellule ridotti e fibre di collagene sparse, sottili o rotte nello strato dermico. Inoltre, questa pelle invecchiata indicava livelli più bassi di contenuto di idrossiprolina e messaggi mRNA per collagene di tipo I, tipo III, MMP-1 e TIMP-1 rispetto al normale tessuto cutaneo., Tutti questi dati suggeriscono che l’iniezione di 125 mg/kg·d D-galattosio per 6 settimane è tecnicamente fattibile per creare un modello di invecchiamento subacuto per imitare l’invecchiamento della pelle umana .

I nostri studi hanno indicato che la coiniezione di DMAE e AA ha aumentato i livelli di contenuto di idrossiprolina e l’espressione di collagene di tipo I della pelle indotta da invecchiamento D-gal, che ha raggiunto approssimativamente lo stesso livello di tessuto cutaneo normale quando viene somministrata un’alta dose di trattamento DMAE + AA 0.2%. I cambiamenti istologici apparivano come spessore epidermico e dermico elevato e fibre di collagene dermico strettamente disposte., Più interessante, Mesoterapia con coiniezione di DMAE e AA notevolmente elevata espressione genica MMP-1 in invecchiamento della pelle ad un livello equivalente di ratti normali, ma non per il suo inibitore di TIMP-1 che è stato significativamente downregulated in tutti i ratti di invecchiamento. Questi risultati suggeriscono che la mesoterapia mediante coiniezione di DMAE e AA ha svolto una regolazione positiva sul catabolismo del collagene nella riparazione e ricostruzione dell’invecchiamento della pelle e ritardare il processo di invecchiamento della pelle., Studi precedenti hanno mostrato la ridotta produzione di collagene di tipo I e una maggiore sintesi di collagene di tipo III e MMP-1 nell’invecchiamento della pelle ; tuttavia, i nostri risultati hanno indicato che l’espressione di mRNA per collagene di tipo III e MMP-1 era molto meno nel controllo dell’invecchiamento rispetto a quella dei ratti normali. Potrebbe essere che il metabolismo del collagene subisce un modo diverso tra i normali cambiamenti della pelle con l’invecchiamento e il modello di invecchiamento della pelle subacuta indotta da D-gal. Il nostro studio ha anche dimostrato che l’iniezione di DMAE o AA da sola non ha mostrato effetti sul contenuto di idrossiprolina o messaggi per collagene di tipo I e MMP-1 nell’invecchiamento della pelle., Questi dati indicano che l’uso concomitante di DMAE e AA potrebbe essere l’unico modo per esercitare la loro azione antiaging in questo modello di invecchiamento cutaneo indotto da D-gal, modulando il metabolismo del collagene di tipo I e rimodellando la struttura dell’invecchiamento cutaneo.

Studi precedenti hanno dimostrato che i fibroblasti dermici di coniglio in coltura hanno risposto al DMAE mediante massiva vacuolizzazione in modo dipendente dalla concentrazione. Anche l’epidermide dell’orecchio esterno del coniglio era significativamente ispessita e mostrava un chiaro gonfiore perinucleare indicativo di vacuolizzazione in risposta all’applicazione topica di 3% DMAE., È stato suggerito che la citopatologia vacuolare potrebbe non essere dissociabile dal miglioramento dell’aspetto cutaneo che viene rapidamente prodotto da DMAE somministrato localmente e potrebbe essere la base cellulare dell’effetto antirughe di DMAE . Dai nostri risultati, la vacuolizzazione del fibroblasto dermico potrebbe verificarsi sia nello 0,1% che nello 0,2% della pelle invecchiata trattata con DMAE, con conseguente gonfiore cellulare e aumento della densità delle fibre di collagene. Le cellule epiteliali della pelle che invecchia potrebbero anche rispondere alla più alta concentrazione di 0,2% DMAE mediante vacuolizzazione, che si presentava come un aumento dello spessore epidermico., Tuttavia, questi potrebbero aver bisogno di ulteriori studi per chiarire la questione.

Inoltre, la misurazione del contenuto di acqua della pelle non ha mostrato differenze tra tutti i ratti trattati, il che suggerisce che DMAE e compound AA hanno avuto effetti limitati sull’idratazione della pelle. Ciò potrebbe essere dovuto ad un livello più basso di concentrazione e ad un periodo di azione più breve di DMAE locale disponibile nello strato epidermico quando l’iniezione sottocutanea diretta è stata usata per la consegna di DMAE, che differisce dall’applicazione topica di DMAE.

5., Conclusioni

Con il modello di invecchiamento indotto da D-galattosio del ratto, la mesoterapia consegnando DMAE e AA direttamente al tessuto bersaglio ha segnato effetti antiaging promuovendo la sintesi e il catabolismo del collagene per rimodellare la struttura della pelle e migliorare lo spessore della pelle invecchiata. Sebbene questi esperimenti abbiano utilizzato un modello di ratto, i risultati sono rilevanti per i lavori clinici., Ulteriori indagini per comprendere il meccanismo dell’azione del dimetilaminoetanolo e dell’amminoacido composto nell’invecchiamento della pelle aiuteranno nello sviluppo e nel test di regimi di cura della pelle più potenti ed efficaci per un’ulteriore valutazione umana.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.