Gli effetti ansiolitici dell’olio essenziale di bergamotto sono insensibili al Flumazenil nei ratti
Abstract
I disturbi d’ansia sono uno dei disturbi mentali più comuni e le benzodiazepine (BDZ), che agiscono sul complesso del recettore dell’acido gamma-aminobutirrico di tipo A (GABA-A), rappresentano i farmaci antianxiety più comuni nel mondo. Tuttavia, l’uso cronico di BDZ suscita diverse reazioni avverse. Secondo quanto riferito, l’aromaterapia è più sicura per la gestione dell’ansia., Olio essenziale di bergamotto (BEO) estratto da agrumi bergamia Risso et Poiteau frutta, come altri oli essenziali, è ampiamente usato in aromaterapia per alleviare i sintomi di ansia indotta da stress. È interessante notare che i dati preclinici indicano che BEO induce effetti ansiolitici / rilassanti in compiti comportamentali animali non sovrapponibili a quelli della benzodiazepina diazepam. Per chiarire meglio il coinvolgimento della trasmissione gabaergica, il presente studio esamina gli effetti del pretrattamento con flumazenil (FLZ), un antagonista del sito delle benzodiazepine, sugli effetti di BEO usando open-field task (OFT) nei ratti., I dati forniti mostrano che la FLZ non influisce in modo significativo sugli effetti comportamentali del fitocomplesso. Questi risultati dimostrano la mancanza di sovrapposizione tra gli effetti comportamentali di BEO e BDZ, contribuendo alla caratterizzazione del profilo neurobiologico dell’olio essenziale per il suo uso razionale in aromaterapia.
1. Introduzione
Diversi oli essenziali estratti dai frutti appartenenti al genere Citrus sono utilizzati in aromaterapia per trattare l’ansia, il sonno, l’umore e i disturbi cognitivi . Si ipotizza che il bergamotto provenga da Citrus aurantium L. e Citrus limon L., o Citrus aurantifolia Swing . L’olio essenziale di bergamotto (BEO) è ottenuto dalla spremitura a freddo dell’epicarpo e, in parte, del mesocarpo del frutto fresco di Citrus bergamia Risso et Poiteau, secondo la Farmacopea italiana XII ed. BEO comprende una frazione volatile (93-96% del totale) contenente derivati ossigenati (come linalolo) e idrocarburi sesquiterpenici e monoterpenici (come limonene) e una frazione non volatile (4-7% del totale) contenente flavoni polimetossilati, cere, cumarine e psoraleni come bergamottina (5-geranilossipsoralene) e bergapten (5-metossipsoralene) ., Limonene, γ-terpinene e β-pinene, insieme al linalolo e all’acetato di linalile sono tra i composti più abbondanti trovati nella frazione volatile e tutti insieme costituiscono >il 90% dell’intero olio . Nell’ultimo decennio, studi preclinici hanno supportato l’uso terapeutico di BEO. In particolare, l’olio di bergamotto è dotato di notevoli effetti neurobiologici derivanti in parte da un’interferenza con meccanismi di base che sintonizzano finemente la plasticità sinaptica in condizioni fisiologiche e patologiche, ovvero,, ischemia cerebrale, dolore e sintomi comportamentali e psicologici della demenza . In condizioni basali, BEO eleva i livelli extracellulari di amminoacidi discreti con funzione di neurotrasmettitore dopo somministrazione sistemica o focale nell’ippocampo di ratti in movimento libero . Inoltre, le dosi sistemiche di BEO aumentano il correlato elettrocorticografico di allerta, veglia e rilassamento ., La capacità di BEO di modificare la frequenza dell’EEG, correlata all’allerta e al rilassamento, supporta i dati che mostrano effetti ansiolitici-rilassanti dopo somministrazione sistemica o per inalazione di questo fitocomplesso in compiti comportamentali negli animali. È interessante notare che si ottengono risultati controversi confrontando gli effetti del BEO con quelli del diazepam (DZP). Infatti, mentre Saiyudthong e Marsden ipotizzano che i componenti attivi del fitocomplesso interagiscano con il sito BDZ sul complesso recettoriale GABA-A inducendo effetti ansiolitici, abbiamo recentemente dimostrato che le proprietà del BEO non si sovrappongono agli effetti del DZP ., Poiché la trasmissione gabaergica svolge un ruolo chiave nella fisiopatologia dei disturbi d’ansia, per ottenere maggiori informazioni sul meccanismo coinvolto negli effetti simili all’ansiolitico di BEO, lo scopo del presente studio è quello di indagare gli effetti di flumazenil, un antagonista del sito di legame BDZ, sul comportamento indotto da BEO nel test in campo aperto (OFT) nei ratti.
2. Materiali e metodi
2.1., Animali
Ratti Wistar maschi (250-300 g; Charles River, Calco, Italia) sono stati alloggiati in gruppi di quattro in gabbie standard di laboratorio (40 × 25 × 15 cm) a temperatura costante (22 ± 1°C) e umidità relativa (50%) in un normale programma chiaro-scuro (luci su 7 am a 7 pm). Prima dell’esperimento OFT, ai ratti era consentita una settimana di adattamento alle condizioni di laboratorio con libero accesso al cibo e all’acqua. La Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) e L. D. 4 marzo 2014 n., 26 è stato seguito per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati ancora generando risultati affidabili.
2.2. Materiali
2.3. Procedura sperimentale
L’acclimatazione dei ratti è stata eseguita per 2 h il giorno dell’esperimento. Gli animali sono stati sottoposti ad assuefazione. Sono stati formati gruppi sperimentali casuali. I ratti sono stati sottoposti a somministrazione intraperitoneale (ip) di BEO (500 µL/kg) o olio di jojoba . IP di FLZ (3 mg/kg), ripristinando effetti BDZ in OFT , o il suo veicolo (interpolazione in soluzione salina) è stato somministrato come pretrattamento 15 minuti prima., Dopo trenta minuti, gli effetti comportamentali sono stati valutati utilizzando il test OF . Questo protocollo sperimentale è conforme ai dati della letteratura in cui il pretrattamento con FLZ ripristina gli effetti comportamentali di diversi prodotti naturali in OFT nei roditori .
Il ratto è stato osservato da uno schermo in un vicino laboratorio poiché il test è stato registrato con una telecamera a circuito chiuso. I test comportamentali sono stati effettuati tra le 09.00 e le 13.00 secondo i ritmi circadiani. Le registrazioni video sono state sottoposte al successivo esame da parte di un osservatore cieco (ignaro dei trattamenti)., Un sovradosaggio di isoflurano è stato usato per eutanasia dell’animale dopo l’esperimento. La stanza comportamentale è stata ventilata e l’arena è stata lavata con acqua e ripulita con etanolo al 70% dopo le sessioni giornaliere per evitare eventuali tracce di odore residue di BEO ed escrementi.
2.4., In Campo aperto di Prova
Il campo aperto, il test è considerato come un indicatore dello stato emotivo dell’animale, che consente un facile e abbastanza veloce valutazione di determinati comportamenti, come l’incrocio, a parete, allevamento, toelettatura, centro, e l’immobilità, ed è ampiamente utilizzato nello screening di farmaci che agiscono sul sistema nervoso centrale (SNC) . In particolare, l’attraversamento e l’allevamento delle pareti possono essere considerati, rispettivamente, indicatori dell’attività locomotoria e del comportamento esplorativo, mentre il grooming, il centro e l’immobilità sono comportamenti positivamente correlati alla paura o all’emotività ., Il ratto è stato posto al centro di un’arena circolare di plastica scura (diametro 75 cm) in una stanza insonorizzata con luce 20 lux . La durata di ogni sessione comportamentale era di 20 min. I parametri valutati (attività locomotoria generale in un intervallo di 5 min (incroci di limiti quadrati con zampe anteriori e allevamento di pareti), comportamento correlato all’ansia (toelettatura del viso e del corpo, lavaggio della testa e tempo trascorso nel centro dell’arena) e immobilità) sono stati videoregistrati e analizzati per essere valutati (Labehaviour).
2.5., Statistiche
L’analisi statistica consisteva in ANOVA a senso unico o bidirezionale, seguita dal test di confronto multiplo di Tukey utilizzando Graph Pad® 6.0. valore < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
L’analisi ANOVA bidirezionale indica differenze tra trattamento e tempo per quanto riguarda le frequenze di attraversamento e di allevamento delle pareti (Tabella 1). In particolare, la somministrazione di BEO riduce entrambi i comportamenti raggiungendo una significatività statistica rispetto al gruppo CTR (Figura 1)., La somministrazione sistemica di FLZ, 15 min prima del BEO, non modifica la diminuzione delle frequenze di attraversamento e di allevamento delle pareti misurata nei ratti trattati con l’olio essenziale (Figura 1).
L’analisi ANOVA unidirezionale indica anche differenze nel tempo di toelettatura, centro e immobilità (Tabella 2). Una diminuzione statisticamente significativa è stata osservata per la toelettatura negli animali trattati con BEO rispetto al gruppo CTR. Il pretrattamento con FLZ non è in grado di prevenire questo effetto (Figura 2).,
Per quanto riguarda il periodo nel mezzo dell’arena, i risultati indicano che la somministrazione sistemica di BEO riduce questo comportamento raggiungendo una significatività statistica rispetto al gruppo CTR (Figura 2). Il pretrattamento con FLZ non influenza questo effetto di BEO sebbene sia mostrata una leggera tendenza () verso un aumento del tempo trascorso al centro (Figura 2).
Inoltre, gli animali trattati con BEO, anche se ancora vigili, trascorrono più tempo in immobilità rispetto al gruppo di controllo (Figura 3)., È interessante notare che negli animali pretrattati con FLZ, si osserva una tendenza a diminuire l’immobilità osservata nel gruppo BEO, sebbene non venga calcolata alcuna differenza statistica () (Figura 3).
Per tutti i parametri studiati, il pretrattamento con FLZ nel gruppo di controllo non influisce sui comportamenti degli animali nei dati della letteratura di supporto OFT utilizzando un ampio intervallo di dosi di 0,1–10 mg / kg .
4., Discussione
BEO, come altri oli essenziali, è ampiamente usato in aromaterapia per ridurre al minimo i sintomi di ansia indotta da stress anche se il meccanismo sottostante e la sua interferenza sulla trasmissione gabaergica rimangono da chiarire .
La somministrazione di BEO esercita effetti simili all’ansiolitico in SPESSO non significativamente contrastati da FLZ, un antagonista del sito BDZ. Questi ultimi risultati confermano che le proprietà di BEO non sono parallele a quelle di BDZs ., Qui abbiamo osservato che l’attività locomotoria e il comportamento esplorativo, misurati dalle frequenze di attraversamento e di allevamento delle pareti, sono ridotti negli animali trattati con BEO rispetto al gruppo veicolo e il pretrattamento con FLZ non è riuscito a prevenire gli effetti del fitocomplesso. Inoltre, nella sessione OFT di 20 minuti, viene misurata una riduzione del comportamento di grooming da parte di BEO che non è influenzata dal pretrattamento con FLZ. Complessivamente, questi risultati indicano che il recettore BDZ non è coinvolto in questi effetti di BEO., Il pretrattamento con FLZ previene parzialmente gli effetti di BEO sull’immobilità e sul tempo trascorso al centro dell’arena, cioè comportamenti positivamente correlati alla paura o all’emotività, sebbene ciò non abbia raggiunto la significatività statistica. È interessante notare che quest’ultimo supporterebbe un coinvolgimento del recettore GABA-A negli effetti del BEO su questi comportamenti. Il recettore GABA-A contiene il sito isosterico per il ligando endogeno e diversi siti di legame allosterico, che modulano indirettamente l’attività del recettore e sono gli obiettivi di vari composti sintetici e naturali ., Molecole con diverse strutture chimiche e affinità influenzano il sito di legame e mostrano distinti effetti farmacologici. In particolare, diverse azioni farmacologiche possono essere attribuite alla modulazione di specifiche subunità alfa . Ad esempio, le proprietà sedative e ipnotiche sono mediate dai recettori GABA-A contenenti subunità alfa-1, mentre la modulazione positiva dei recettori GABA-A alle subunità alfa-2 e/o alfa-3 mostra effetti ansiolitici .,
È interessante notare che, in precedenza, abbiamo dimostrato che la somministrazione sistemica di BEO induce un rilascio moderato di GABA nell’ippocampo di ratti che si muovono liberamente . Questa scoperta neurochimica, insieme agli effetti di FLZ sull’immobilità e sul centro riportati qui, potrebbe supportare l’ipotesi che alcuni dei composti presenti nel fitocomplesso potrebbero interferire con la trasmissione mediata dal recettore GABA-A. Diversi studi hanno studiato il coinvolgimento di questa neurotrasmissione negli effetti ansiolitici di singoli composti volatili presenti negli oli essenziali come il BEO., In particolare, gli autori suggeriscono che la via di somministrazione dei composti potrebbe modulare la loro azione sul sito BDZ che influenza gli effetti ansiolitici. Ad esempio, linalolo, somministrato per inalazione , induce effetti ansiolitici prevenuti da FLZ, mentre la somministrazione sistemica non produce effetti ansiolitici . Inoltre, la somministrazione sistemica di una miscela di cis e trans (+)-limonene epossido induce effetti ansiolitici che sono prevenuti dal pretrattamento con FLZ . Tuttavia, quando il (R)-(+)-limonene viene somministrato per inalazione, l’effetto ansiolitico non viene bloccato dall’antagonista del sito BDZ .,
Altri sistemi di neurotrasmettitori sono stati implicati negli effetti ansiolitici indotti dagli oli essenziali. Ad esempio, i topi sottoposti a inalazione di olio di limone presentano un effetto antistress attraverso la modulazione della neurotrasmissione dopaminergica, serotoninergica e gabaergica . L’inalazione di olio essenziale di lavanda mostra effetti ansiolitici aumentando il livello di serotonina (5-HT) nella corteccia prefrontale, nello striato e nell’ippocampo ., Inoltre, WAY100635, un antagonista del recettore 5-HT, blocca l’azione dell’olio essenziale di lavanda mentre l’uso di antagonisti del recettore GABA-A è privo di effetto . Dati simili sono raggiunti anche da Galdino et al. e da Tabari et al. che hanno osservato effetti ansiolitici dopo l’iniezione sistemica di Spiranthera odoratissima e oli essenziali di geranio rosa contrastati dal pretrattamento con antagonisti del recettore 5-HT1A ma non da FLZ .,
Complessivamente, questi dati supportano l’ipotesi che gli effetti ansiolitici degli oli essenziali e probabilmente del BEO possano essere sottolineati da molteplici meccanismi complessi che meritano ulteriori indagini.
5. Conclusione
I BDZ sono farmaci ben sviluppati e comunemente prescritti usati per trattare i disturbi d’ansia; tuttavia, diversi effetti collaterali (ad esempio letargia, vertigini, sonnolenza, sedazione e dipendenza) possono essere gravi, quindi è necessario lo sviluppo di nuovi farmaci., Queste reazioni avverse hanno spinto la diffusione dell’aromaterapia, anche se sono disponibili dati limitati sui meccanismi alla base dell’attività ansiolitica degli oli essenziali. I risultati del nostro studio contribuiscono ad approfondire la caratterizzazione del profilo neurofarmacologico di BEO. Questi ultimi supportano l’ipotesi che gli effetti ansiolitici di questo fitocomplesso non siano sovrapponibili a quelli delle BDZ e al suo uso aromaterapeutico per il trattamento dell’ansia indotta da stress.,
Disponibilità dei dati
I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Guido Fico per il sapiente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Università della Calabria “ex quota 60%.”