Risoluzione del microscopio: Concetti, fattori e calcolo
Prendendo in considerazione tutte le teorie di cui sopra, è chiaro che ci sono una serie di fattori da considerare quando si calcolano i limiti teorici della risoluzione. La risoluzione dipende anche dalla natura del campione. Diamo un’occhiata al calcolo della risoluzione usando il limite di diffrazione di Abbe e usando anche il criterio di Rayleigh.,
In primo luogo, va ricordato che:
NA= n x sin α
Dove n è l’indice di rifrazione del mezzo di imaging e α è la metà dell’apertura angolare dell’obiettivo. L’apertura angolare massima di un obiettivo è di circa 144º. Il seno della metà di questo angolo è 0,95. Se si utilizza un obiettivo ad immersione con olio che ha un indice di rifrazione di 1,52, il NA massimo dell’obiettivo sarà 1,45. Se si utilizza un’ secco ‘ (non-immersione) obiettivo il massimo NA dell’obiettivo sarà 0.95 (come l’aria ha un indice di rifrazione di 1.0).
Formula di diffrazione di Abbe per laterale (cioè, XY) la risoluzione è:
d= λ/2 NA
Dove λ è la lunghezza d’onda della luce utilizzata per l’immagine di un campione. Se si utilizza una luce verde di 514 nm e un obiettivo di immersione in olio con NA di 1,45, il limite (teorico) di risoluzione sarà di 177 nm.
La formula di diffrazione di Abbe per la risoluzione assiale (cioè Z) è:
d= 2 λ/NA2
Ancora una volta, se assumiamo una lunghezza d’onda di 514 nm per osservare un campione con un valore obiettivo di NA di 1,45, allora la risoluzione assiale sarà di 488 nm.
Il criterio di Rayleigh è una formula leggermente raffinata basata sui limiti di diffrazione di Abbe:
R= 1.,22 λ / NAobj + NAcond
Dove λ è la lunghezza d’onda della luce utilizzata per l’immagine di un campione. NAobj è la NA dell’obiettivo. NAcond è il NA del condensatore. La cifra di ‘1.22’ è una costante. Questo deriva dal lavoro di Rayleigh sulle funzioni di Bessel. Questi sono utilizzati per calcolare i problemi in sistemi come la propagazione delle onde.
Prendendo in considerazione il NA del condensatore, l’aria (con un indice di rifrazione di 1,0) è generalmente il mezzo di imaging tra il condensatore e il vetrino. Supponendo che il condensatore abbia un’apertura angolare di 144º, il valore di NAcond sarà uguale a 0,95.,
Se si utilizza una luce verde di 514 nm, un obiettivo ad immersione in olio con NA di 1,45, un condensatore con NA di 0,95, il limite (teorico) di risoluzione sarà di 261 nm.
Come detto sopra, più breve è la lunghezza d’onda della luce utilizzata per l’immagine di un campione, quindi più dettagli saranno risolti. Quindi, se si utilizza la più breve lunghezza d’onda visibile della luce di 400 nm, con un obiettivo di immersione in olio con un NA di 1,45 e un condensatore con un NA di 0,95, allora R sarebbe uguale a 203 nm.,
Per ottenere la risoluzione massima (teorica) in un sistema di microscopi, ciascuno dei componenti ottici deve avere la NA più alta disponibile (tenendo conto dell’apertura angolare). Inoltre, utilizzando una lunghezza d’onda più corta della luce per visualizzare il campione aumenterà la risoluzione. Infine, l’intero sistema del microscopio dovrebbe essere allineato correttamente.