血球計を用いた細胞の計数

図1. 血球計グリッドライン。
カウントに使用する必要があります16の正方形のセットのいずれかを示す血球計図。

ウェビナー転写産物

細胞を数えることにより、細胞数の正確な決定、したがって実験間の一貫性が可能になります。 このビデオでは、血球計を用いて懸濁液および付着細胞の両方を計数する手順について概説します。

作業を開始する前に、層流安全キャビネットの内部に消毒剤を徹底的にスプレーし、組織できれいに拭いてください。, 使用済みのティッシュを適切なゴミ箱に捨てます。 次に、フードの内側に70％のエタノールをスプレーし、組織できれいに拭きます。 フードは今きれい、使用可能である。 冷蔵庫から細胞培養培地とトリプシンを取り出し、加湿された37℃の二酸化炭素インキュベーターに入れて暖めます。 その間、細菌および菌類の汚染の視覚徴候があるように点検するのに顕微鏡を使用して数えられるべきセルを見て下さい。 層流の安全キャビネットで遊ぶ前の70%のエタノールが付いている媒体のびんそしてピペットに吹き,

懸濁細胞については、フラスコを静かに攪拌して、細胞が十分に混合されるようにする。 それらが解決するチャンスを得る前に生殖不能のeppendorfの管に細胞懸濁液およびピペットの0.5ミリリットルのサンプルを取りなさい。 付着した細胞については、既存の培地を除去し、室温PBSで洗浄し、トリプシンEDTAを添加して細胞を分離する。 必要なPBSおよびトリプシンの量については、表を参照してください。 加湿した37℃、二酸化炭素インキュベーターで二から五分間細胞をインキュベートします。 インキュベーション時間は、細胞タイプに最適化する必要があります。, すべての細胞が切り離されると、細胞および培養に適した増殖培地を含む温かい血清でトリプシンＥＤＴＡを中和する。 必要なボリュームは表Oneを参照してください。

細胞懸濁液を上下に三回穏やかにピペッティングすることによって細胞を再懸濁し、50ミリリットルの管に移しなさい。 細胞懸濁液を室温で毎分1,000回転で五分間遠心分離する。, 無菌の血清学のピペットを使用して上清を取除き、開始の文化の元の容積に成長培地を含んでいる37度C血清が付いている細胞のパレットを再 五ミリリットルの滅菌ピペットを使用して、細胞懸濁液の0.5ミリリットルのサンプルを取り、滅菌eppendorfチューブに転送します。

計数するために、使い捨ての血球計を準備する。 P2000ギルソンピペットを使用して、懸濁液の100マイクロリットルを取り、トリパンブルー、ノートの400マイクロリットルに追加します。08％とよく混ぜる。, Trypanの青い細胞の懸濁液の組合せの100マイクロリットルを取り、注意深くカウントの部屋の井戸に懸濁液の低下をピペットで運び、サンプルを引くように毛管作用がする。 計数室を埋め過ぎないように注意してください。 逆にされた顕微鏡を使用して10回の拡大の下でカウント区域を見なさい。 顕微鏡を使用して、血球計上の四つずつのグリッドのいずれかに焦点を当て、トリパンブルーの陰性で細胞を数えます。 これらは実行可能です。 また、トリパンブルーに対して陽性であった細胞の数にも注意してください。, これらの細胞は死滅しており、この数は、必要に応じて培養物の生存率の百分率を計算するために後で使用することができる。

計数するときは、セルが正方形内にある場合、または右手または下の境界線上にある場合にのみ計数されるシステムを採用する。 この16個の正方形のセットでカウントされた細胞の数を記録し、血球計の16個の正方形のすべてのセットがカウントされ、その値が記録されるまで, 細胞濃度を計算するには、16平方の四組の生存細胞の平均数を取り、ミリリットル当たりの細胞の数を得るために10,000を掛けます。 次に、これに五を掛けて、トリパンブルー添加から五希釈で一つを補正します。 この最終値は、元の細胞懸濁液中のミリリットル当たりの生存細胞の数である。,

たとえば、生細胞数が200,000ミリリットルの体積で20ミリリットル当たりの細胞であり、10,000個の細胞を新しいフラスコに見たい場合は、50マイクロリットルの細胞懸濁液を新しいフラスコに移す必要があります。 必要量の細胞懸濁液を新しいフラスコに移す。 媒体と満たし、定温器に入れて下さい。

---