ラットのD-ガラクトース誘発皮膚老化モデルに及ぼすジメチルアミノエタノールおよび化合物アミノ酸の影響
概要
人間の永続的な夢は、老化 メソセラピーにおけるジメチルアミノエタノール（ＤＭＡＥ）と化合物アミノ酸（ＡＡ）を，Ｄ-ガラクトース誘発性老化皮膚に対する抗老化効果について調べた。 D-gal誘導後18日で、各ラットは、それぞれ、生理食塩水、AA、0.1％DMAE、0.2％DMAE、0.1％DMAE+AA、または0.2％DMAE+AAの皮内マイクロインジェクションで処理した。, 処置の42日後に、皮膚創傷を採取し、アッセイした。 0.1%DMAE+AAおよび0.2%DMAE+AAグループの表皮および皮膚厚さの測定は老化の対照ラットよりかなり厚く現われました。 組織水分content量には群間で差はなかった。 0.1％DMAE+AA、0.2％DMAE+AA、および偽の対照群のヒドロキシプロリンは、他のすべての群よりもはるかに高かった。 コラーゲンタイプI、タイプIII、およびMMP-1発現は、老化コントロールと比較して0.1％DMAE+AAおよび0.2％DMAE+AAグループの両方で高度にアップレギュレートされた。, 対照的に、様々な老化群のTIMP-1発現レベルは、偽のコントロールと比較したときに有意に減少した。 標的組織へのＤＭＡＥおよびＡＡの共注入は，ラットのＤ-ガラクトース誘発皮膚老化モデルに対する顕著な老化防止効果を有する。
1. はじめに
アンチエイジングは永遠の話題であり、人間の夢です。, 加齢に伴う皮膚の変化は避けられないものであり、薄くなり、たるみ、しわ、弾力性の喪失、乾燥の領域、およびコラーゲンI型の合成が減少したが、コラーゲンIII型の生産が増加したとして提示された皮膚におけるコラーゲンI型/III比の逆転回転が含まれる。 現在Mesotherapyはずっとantiaging作戦として皆の興味を覚醒させています。, これは、栄養素、ホルモン、ビタミン、酵素、およびその他の試薬などの薬理学的物質の皮内マイクロインジェクションからなり、希釈され、治療される領域に直接投与される低侵襲手順である。 生殖不能および専門の処理の下で、Mesotherapyは注入の間に膨張および苦痛のようなあるマイナーな危険を除いて非常にまれに皮の伝染および壊死の悩みを、, いわゆる”ランチタイム化粧品の手順”の一つである安全で、シンプルで、痛みの少ない手順として、それは回復時間を必要とせず、テンポの速い現代生活の中で専門家や成功した人々に最適です。
ジメチルアミノエタノール（DMAE）は、ビタミンBコリンの類似体であり、アセチルコリンの前駆体であり、アンチエイジング、アンチしわ、肌のハリの急性効果のために、今日のエキサイティングな新しいスキンケアサプリメントとして注目されている。 DMAEは、外部用途での使用でよく知られています。, 無作為化された臨床調査では、3%DMAEの顔のゲルは額ラインおよびperiorbital良いしわの軽減と顔の皮の唇の十分および形および全面的な出現改善で安全、効 試験のオープンラベルの延長はまた1年までのDMAEのゲルの長期適用がよい安全プロフィールと関連付けられたことを示しました。, しかしながら、DMAEによる熱帯治療は、通常、表皮透過性バリアを通過するために高用量および濃度を必要とし、その毒性、副作用および医療費の懸念を 2.5–10mmol/mL DMAEは、in vitro培養ヒト線維芽細胞細胞の空胞細胞病理学を引き起こす可能性があることが報告された。 さらに、研究は、3％DMAEゲルを熱帯的に適用すると、ウサギ耳表皮細胞の空胞細胞病理学も引き起こす可能性があることを示した。 老化した皮膚の改善のための相対的有効性を評価するためには、DMAEの代替送達が必要である。,局所マイクロインジェクション（メソセラピー）によって皮内投与される低用量ＤＭＡＥの潜在的な老化防止効果を評価するために，Ｄ-ｇａｌ誘発老化皮膚の組織構造およびコラーゲン代謝を測定した。 一方、DMAE注射による細胞毒性の低下をもたらし、局所栄養供給である化合物アミノ酸（AA）の共注入も研究された。 皮膚におけるそれらの考えられる作用機序についても述べた。
2. 材料および方法
2.1., 動物
雄のWistarラットは、Institute of pharmaceutical Sciences(Qingdao,China)から購入した。 すべての動物は、手術時に180-220グラムの重みを付けました。 動物ケアおよび実験プロトコルは、青島大学医学院機関の動物ケアおよび使用委員会の附属病院によって承認された。
合計80Wistarラットを各実験群にランダムに分割した（表1に詳述）。, 偽対照群を除く各治療群の動物は、ラットの皮膚老化モデルを誘導するために125mg/kg·dの用量でD-ガラクトース（D-gal）を6週間にわたって皮下注射した。 D-gal注射後18日で、各ラットはクロラール水和物（0.25mL/100g体重）で麻酔し、その股関節領域内で消毒した。 3センチメートルラウンドタトゥーエリアは、ラットの股関節の両側にプレハブし、生理食塩水（NS）、AA、0.1％DMAE、0.2％DMAE、0.1％DMAE+AA、または0の皮内マイクロインジェク,それぞれ2％DMAE+AA。 老化陰性対照群と偽対照群は全く同じ外科的処置を受けたが，研究中の治療はなかった。 治療後42日で、すべての動物を安楽死させ、皮膚創傷を組織学、含水量の測定、ヒドロキシプロリン含量、および定量的リアルタイムPCR試験によって比較
2.2. 病理組織学
皮膚の厚さは、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された切片において、SimplePCI画像解析ソフトウェア（Hamamatsu Corporation、Boston、MA）を用いて測定した。, 表皮の厚さは角質層（ＳＣ）表面から真皮乳頭の底部まで測定し，真皮厚さは乳頭頂部から網状真皮の最も深い部分まで脂肪組織または筋肉に達するまで測定した。 同じ倍率の下で、5つの個々の位置をランダムに選択して、セクションあたりの5つの視野のそれぞれから皮膚の厚さを測定した。 すべてのセクションのマッソントリクロム染色では、ビューの5つの異なるフィールドもランダムに選択され、コラーゲン線維密度
2.3., 水分Content量の測定
1cm2の皮膚創傷を採取し、正確な湿式重量を測定し、続いて80℃で12時間焼成し、その乾燥重量を測定した。 皮膚水分量は、水分量の百分率＝（（湿潤重量−乾燥重量）÷湿潤重量）×100％の式により算出した。
2.4. ヒドロキシプロリン含量の測定
皮膚創傷中のヒドロキシプロリン含量は、市販のアッセイキットの製造プロトコル（南京JIANCHEN biological engineering Co.、株式会社、南京、中国）。
2.5., 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）
皮膚創傷をTRIzol1（Invitrogen）で均質化し、製造業者のプロトコルに従って全RNAを抽出した。 PrimeScript RT合成システム（タカラバイオテクノロジー／タカラバイオ、中国大連）を用いて、1μgのトータルRNAをcDNAに逆転写した。 これらのｃｄｎａ産物を用いて高感度定量ＰＣＲ法を行った。 すべてのカスタマイズプライマーおよびプローブの検証を効率（図表2）。, 10mLの反応ミックスには、2x Power SYBR1Green PCR Master Mix、10倍希釈cDNA、および各プライマーの0.2mmが含まれていました。 熱プロトコルは、10分のポリメラーゼ活性化95°Cで、40サイクルの変性95°Cで30秒、55°Cで1分のプライマーアニーリング、72°Cで30秒の拡張から成っていた。mRNA発現レベルは、内因性参照遺伝子β作用のものに正規化され、老化コントロール皮膚サンプルから得られたものに倍の変化として提示された。,
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2.6. Statistical Analysis
Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., この結果は、の確率レベルで統計的に有意であるとみなされた。
3. 結果
3.1. 組織学的変化
老化した皮膚は、偽コントロールラットと比較して表皮と真皮の両方の厚さが減少したことを示した。 加齢とともに，表皮は細胞層の数を減少させ，真皮コラーゲン線維は疎，細い，または壊れていた。 しかし、加齢対照と比較すると、これらの組織学的変化は0.1％DMAE+AA、0.2％DMAE+AA、および0.2％DMAE群で大幅に改善された（図1（a）-1（h））。
0.1%DMAE+AAまたは0で処理した場合。,2％DMAE+AA、表皮および真皮の厚さおよびコラーゲン繊維の密度の両方が、老化対照群のものよりも有意に上昇した。 さらに、単独で0.2%DMAEはまたかなり老化の制御と比較されたときコラーゲン繊維の表皮の厚さそして密度を高めました。 しかし、それにもかかわらず、すべての老化群におけるこれらの三つのパラメータは、偽対照群（図2（a）、2（b）、および2（c））のものと比較したときに大幅にダウン
3.2. 老化した皮膚における水分Content量
すべてのグループの間で水分content量に統計的に有意な差はなかった（図2（d））。,
3.3. ヒドロキシプロリン含量
ヒドロキシプロリン含量は、他のすべての老化群と比較して有意な差を示した0.1％DMAE+AAおよび0.2％DMAE+AA複合体の両方で処理 興味深いことに、0.2％DMAE+AA群のヒドロキシプロリン含量は、偽のコントロールと同等のレベルに達したが、他のすべての6老化群よりも有意に高かった。 0.1%DMAE+AA群と0.2%DMAE+AA群の間に有意差はなかった（図2（e））。
3.4., タイプI、タイプIIIプロコラーゲン、MMP-1、およびTIMP-1標的遺伝子
コラーゲンタイプI発現が大幅に偽のコントロールのそれに有意差を示さなかった0.1％DMAE+AAと0.2％DMAE+AA治療の両方に応答してアップレギュレートされた。 しかしながら、他の老化群のいずれも、偽対照ラットと比較して、I型コラーゲンの発現がはるかに少なかった（図3（a））。 0.1%DMAE+AA、0.2%DMAE+AA、または0で処理した場合。,2%DMAE単独では、コラーゲンIII型の転写産物レベルは、加齢対照群に対してかなり上昇したが、偽対照群よりも有意に低かった（図3（b））。 皮膚老化における潜在的なキーレギュレータとして、MMP-1メッセージは0.1％DMAE+AAまたは0.2％DMAE+AA治療のいずれかに応答して増加し、これは加齢対照ラットと統計的に有意な差を示したが、偽対照ラットではなかった（図3（c））。 対照的に、すべての老化群におけるTIMP-1の転写産物レベルは、偽コントロールのそれのはるかに低いレベルに有意にダウンレギュレートされた（図3（d））。,
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., 皮膚創傷を処理し、定量的RT-PCRによってコラーゲンi型（a）、コラーゲンIII型（b）、MMP-1（c）およびその阻害剤、およびTIMP-1（d）の発現を分析した。 各標的化遺伝子の発現レベルを内因性参照遺伝子に対して正規化し、加齢対照群から得られたものに対する相対値（Δδｃｔ）として報告した。 およびγは、それぞれ陰性対照（グループ1）および偽対照（グループ8）と比較した場合の有意差（）を示す。
4., Discussion
低用量のD-ガラクトースをラット皮膚に注射すると、老化の加速に似た変化が誘発される可能性がある。 我々の研究では、ラットの老化モデルは、髪の色の変化、活動の減少、および神経学的障害を示した。 Ｄ-ｇａｌの組織学的変化は，皮膚層に細胞層が減少し，疎，細い，または壊れたコラーゲン線維を有するより薄い表皮として提示された老化を誘発した。 さらに、この老化した皮膚は、正常な皮膚組織と比較して、I型、III型コラーゲン、MMP-1、およびTIMP-1のヒドロキシプロリン含量およびmRNAメッセージの低レベル, これらのデータはすべて、125mg/kg·d D-ガラクトースを6週間注入することは、ヒトの老化した皮膚を模倣するための亜急性老化モデルを作成するため
我々の研究は、DMAEとAAの共注入は、0.2％DMAE+AA治療の高用量を与えられたときに正常な皮膚組織のほぼ同じレベルに達したヒドロキシプロリン含量とD-galのコラーゲンi型発現のレベルを増加させたことを示した。 組織学的変化は表皮および真皮の厚さの上昇および真皮コラーゲン線維のしっかりと配列したものとして現れた。, さらに興味深いことに、DMAEとAAのコインジェクションによるメソセラピーが大幅に正常なラットの同等のレベルに老化した皮膚におけるMMP-1遺伝子発現を上昇させたが、すべての老化ラットで有意にダウンレギュレートされたTIMP-1の阻害剤のためではなかった。 これらの結果から，ＤＭＡＥとＡＡの共注入によるメソセラピーは，老化皮膚の修復および再建においてコラーゲン異化作用に正の調節を果たし，皮膚の老化過程を遅らせることが示唆された。, 以前の研究では、コラーゲンI型の生産の減少と老化した皮膚におけるコラーゲンIII型およびMMP-1の合成の増加を示したが、我々の結果は、コラーゲンIII型およびMMP-1のmRNA発現が正常ラットよりも老化コントロールにおいてはるかに少なかったことを示した。 コラーゲン代謝は加齢に伴う正常皮膚変化とＤ-ｇａｌ誘発性亜急性皮膚老化モデルとで異なる方法を受ける可能性がある。 私達の調査はまた単独でDMAEまたはAAの注入が老化の皮のタイプIのコラーゲンそしてMMP-1のためのヒドロキシプロリンの内容またはメッセージに対, これらのデータは，Ｄ-ｇａｌ誘発老化皮膚モデルにおいて，コラーゲンｉ型代謝を調節し，老化皮膚の構造を再モルディングすることにより，ＤＭＡＥとＡＡの併用が老化防止作用を発揮する唯一の方法であることを示している。
これまでの研究では、培養ウサギ真皮線維芽細胞が濃度依存的に大量の空胞化によってDMAEに応答することが示されている。 ウサギ外耳の表皮も有意に肥厚し、3％DMAEの局所適用に応答して空胞化を示す明確な核周囲腫脹を示した。, 液胞細胞病理は局所投与ＤＭＡＥによって急速に産生される皮膚外観の改善から解離できず，ＤＭＡＥの抗しわ効果の細胞基盤であることが示唆された。 我々の結果から、皮膚線維芽細胞の空胞化は、細胞の腫脹およびコラーゲン線維密度の増加をもたらす、0.1％および0.2％DMAE処理老化皮膚の両方で起こり得る。 老化した皮膚の上皮細胞はまた、表皮の厚さの増加として提示された空胞化によって0.2％DMAEの高濃度に応答することができる。, しかし、これらが必要と考えられ研究で明らかにする。さらに、皮膚水分量の測定は、すべての処理ラット間で差を示さず、DMAEおよび化合物AAが皮膚保湿に対する影響が限られていることを示唆している。 これは、DMAEの局所適用とは異なる直接皮下注射をDMAE送達に使用した場合、表皮層における局所利用可能DMAEの濃度レベルが低く、作用期間が短いためであると考えられる。
5., 結論
ラットのD-ガラクトース誘導老化モデルでは、DMAEおよびAAを標的組織に直接提供することによるメソセラピーは、皮膚の質感を改造するためのコラーゲン合成および異化作用を促進し、老化した皮膚の厚さを改善することによって、老化防止効果を顕著に示した。 これらの実験はラットモデルを使用したが、結果は臨床的研究に関連している。, 老化の皮のdimethylaminoethanolそして混合のアミノ酸の行為のメカニズムを理解するそれ以上の調査はそれ以上の人間の評価のためのより強力で、有効なskincareの養生法の開発そしてテストで助けます。
利益相反
著者は、この論文の出版に関して利益相反はないことを宣言している。