コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定のための方法の
生化学キャラクタリゼーション
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定のための方法の比較
Maria de Lourdes RS CunhaI,1;Yuri K SinzatoI;Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de bioestatística,instituto de biociúncias,universidade estadual paulista,18618-000BOTUCATU,sp,brasil
概要
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Cns）種の同定は、ほとんどの臨床検査室では依然として困難である。, KloosとSchleiferによって提案され、Bannermanによって修正されたスキームは、ブドウ球菌種および亜種の同定に使用される基準法であるが、この方法は多数の生化学的検査を利用する必要があるため、日常的に使用するためには比較的苦労である。 本研究の目的は、100CNS株の同定において、リファレンス法、APIブドウ球菌システム（bioMérieux）と私たちの研究室でのリファレンス法（簡易法とディスク法）から変更された二つの方法を比較することでした。, 参照法と比較して、簡易法およびディスク法は、それぞれCNS種の100および99％を正しく同定したが、この率はAPIブドウ球菌システムでは84％であった。 APIブドウ球菌メソッドによる不正確な同定は、ブドウ球菌epidermidis（2.2％）、S.hominis（25％）、S.haemolyticus（37.5％）、およびS.warneri（47.1％）について観察された。, 本研究で提案された単純な同定スキームを用いた単純化された方法は、100％の感度と特異性で、テストされたすべての株に対して効率的であることが この方法は、特に限られた資源を持つ場所で、臨床微生物学研究室で非常に有用であろう。,
キーワード：コアグラーゼ陰性ブドウ球菌-メソッド-同定-APIブドウ球菌
これまでにブドウ球菌属の四十種が同定されている（Trülzsch et al. 2002,Bannerman2003,Kwok&Chow2003,Spergser et al. 2003). S., 一連の他の酵素や毒素を産生するコアグラーゼ陽性種である黄色ブドウ球菌は最もよく知られており、動物やヒトにおける一連の感染や中毒の病因に頻繁に関与しているが、大部分の種を代表するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（CNS）は腐生性またはまれに病原性であると考えられている（Kloos&Schleifer1975）。, しかし、最後の十年にわたって、CNSは、血液培養から最も一般的に単離された微生物を表す一連の感染プロセスの病因として認識されている（Huebner&Goldmann1999）。
CNS種の約半分が自然にヒトにコロニーを形成し、現在、それらは本質的に日和見病因と考えられており、重度の感染症を引き起こすために多くの有機, 異なる感染症の病原体としてのCNSの出現は、集中治療を受けている患者、免疫不全患者、未熟児、新生物を有する患者、および移植患者（Kloos&Bannerman1994）における血管内カテーテルおよびプロテーゼなどの侵襲的処置の使用の増加の結果であり得る。
ヒトにおいて最も頻繁に病気を引き起こす種はSである。, epidermidis（菌血症、語頭音添加およびカテーテルのような植え付けられた医療機器による伝染、外科傷の伝染、連続的な腹膜の透析の患者の腹膜炎、骨髄炎、endophthalmitis等。）、S.haemolyticus（心内膜炎、腹膜炎、敗血症、および尿路、創傷、骨および関節の感染症）、およびs.saprophyticus（尿路感染症および敗血症プロセス）。 他の重要な日和見病原体としては、S.hominis、S.warneri、S.capitis、S.simulans、S.cohnii、S.xylosus、およびS.saccharolyticus（Bannerman2003）が挙げられる。 S., lugdunensisは、人工弁の移植後の心内膜炎、腹膜炎、軟部組織感染、および椎骨骨髄炎と関連しているようである（Osmon et al. 2000).
病院環境におけるCNSの既知の病原性ポテンシャルを考慮して、感染に関連する種の多様性とその毒素原性および病原性に関する関心は、過去十年間にわたって増加しており、これらの側面に関する様々な研究の出版につながっている。, しかしながら、CNS感染の成長特性評価にもかかわらず、これらの微生物は臨床微生物学研究所では同定されていない。 Kloos and Schleifer(1975)によって提案され、Bannerman(2003)によって修正されたスキームは、従来使用されている方法であるが、この方法は多数の生化学的試験が必要であるため、日常的な使用には比較的苦労である。, ルーチンのほとんどの実験室では、ぶどう状球菌はS.aureusおよび非s.aureusの分離株にぶどう状球菌の分類だけを可能にするCNSとして単に分類されていて、コロニー、グラム汚損およびカタラーゼおよびcoagulaseの生産の形態学的側面に基づいて識別されます。
ブドウ球菌種および亜種の同定のための方法の開発は、臨床医が臨床標本中に存在する様々なCNSに関する情報を取得し、それらを感染プロセスの病因因子として考慮することを可能にする。, 各臨床分離株の潜在的な病原性または抗生物質感受性を早期に予測し，それぞれの種の臨床的意義を明らかにするためには，ＣＮＳの正確な同定が必要である。 浸潤性疾患を有する患者からの繰り返しＣＮＳ分離株を同定して、株の比較を可能にするべきである。 一方、疫学研究のためのタイピング手順が行われる前に、種の同定が前提条件である。,
近年、ブドウ球菌の迅速な同定のためのいくつかの商用システムが、古典的な同定プロトコル（Bannerman2003）の代替として開発されている。 しかし、これらの診断システムの現在の問題などのコストや、複数のインキュベーション時にできることが多い信頼できない結果を与et al. 1994,Perl et al. 1994). さらに、これらのキットの多くは、すべての既知のＣＮＳ種（すなわち、臨床的、獣医的、および消化的分離株）の同定のために設計されたものであり、したがって、あまり特異的ではない。, 上記の考慮事項に基づいて、迅速で簡単で信頼性の高い方法の必要性を考慮して、本研究の目的は、CNSの同定のための四つの技術、すなわち参照法（Kloos&Schleifer1975,Bannerman2003）、市販のAPIブドウ球菌システム、および私たちの研究室では、シンプルさ、信頼性、低コストを組み合わせた代替同定法を開発するために変更された二つの方法を比較することであった。,
材料と方法
分離株-ボツカトゥキャンパスの医学部の大学病院に入院した患者の臨床標本から得られた百CNS分離株を研究した。 株をＫｏｎｅｍａｎらにより記載されているように単離した。 (1997).
CNSの同定-臨床標本から得られた分離株は、それらの純度およびそれらの形態および特異的染色の保存を保証するために、血液寒天およびグラム染色, これらの特性を確認した後，分離株をカタラーゼおよびコアグラーゼ試験に提出した。 ブドウ球菌は、グルコースの酸化および発酵に基づいてMicrococcus種から区別され、バシトラシン（0.04U）に対する抵抗性は、直径9mmまでの阻害ハローまたは阻害ハローの存在によって示され、フラゾリドン（100μg）に対する感受性は直径15-35mm（Baker1984）を測定する阻害ゾーンによって特徴付けられた。
ＣＮＳの同定には、以下に記載する四つの方法を用いた。, 以下の国際参照CNS株を対照として使用した：s.epidermidis（ATCC12228）、S.simulans（ATCC27851）、S.warneri（ATCC10209）、S.xylosus（ATCC29979）、およびS.saprophyticus（ATCC15305）。,
Kloos and Schleifer(1975)およびBannerman(2003)によって提案された参照法-この方法は、糖キシロース、アラビノース、ショ糖、トレハロース、マルトース、マンニトール、乳糖、キシリトール、リボース、フルクトース、およびマンノースの利用、溶血素の産生、硝酸塩還元、ウレアーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼの存在、および最大16mmの阻害によって特徴づけられるノボビオシンに対する耐性を決定する一連の生化学試験からなる。テストの24、48、および72時間のインキュベーションの後に空気インキュベーターで37ºcで得られました。,
API Staph-API Staphシステム（bioMérieux）は20の生化学的なテストから成っている使用可能なテスト電池であり、0.5McFarlandの濁り度の同種の細菌の懸濁液は加えられる。 24時間のインキュベーションを37℃で行い、キットに付随するVP（VP1およびVP2）、NIT（NIT1およびNIT2）、およびPAL（ZYM AおよびZYM B）試薬を添加した後、反応を解釈し、, 識別は、パーセント識別（％ID）を提供する七桁からなる数値システムに基づいており、値>80％が許容されます。
修正法-私たちの研究室で修正された二つの同定法（簡易法とディスク法）を使用しました。 単純化した方法を二つのステップに分けた。 最初のステップでは、キシロース、ショ糖、トレハロース、マルトース、およびマンニトールの発酵、溶血素の産生、およびチオグリコール酸中の嫌気性成長を試験した（表ｉ）。, 第二ステップで使用されるテストは、72-hインキュベーション後の最初の同定ステップで得られた結果に従って変化した37℃で。 第二段階（必要に応じて）で使用される補完試験は、表IIに指定されています。
ディスク法は、アラビノース、スクロース、トレハロース、マルトース、マンニトールおよびラクトースの発酵、硝酸塩還元、溶血素の産生、ウレアーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼの試験、およびノボビオシンに対する耐性からなっていた。, 糖発酵試験のために、各糖に特異的な市販のディスクを2.5mlの紫色のブロスベース培地を含むチューブに入れた。 細菌懸濁液を、KloosおよびSchleifer(1975)によって記載されているように接種した。 二つの方法のための測定値は、24、48、および72℃でのインキュベーションの37時間後に得られ、CNS種は、図で提案された同定スキームに従って同定された。,
統計分析-CNSの同定に使用される方法（簡易法、ディスク法およびAPIブドウ球菌）と参照法（Kloos&Schleifer1975、Bannerman2003）との間の一致の程度を決定するために、試験（Sox1986）の感度および特異性を以下のように評価した。,
感度：参照法によって特定の種について陽性であり、分析された方法（簡易法、diskまたはAPIブドウ球菌）によって同じ種として同定されたCNS株の割合。
特異性：参照法によって特定の種について陰性であり、分析された方法（簡易法、diskまたはAPIブドウ球菌）によって試験されたときに同じ種についても陰性であったCNS株の割合。
結果
100ブドウ球菌分離株は、四つの提案された方法によってテストされました。, 参照法（Kloos&Schleifer1975、Bannerman2003）で得られた結果を、修正された方法およびAPIブドウ球菌システムで得られた結果と比較した。
表IIIは、分析されたアッセイと参照方法との間の同定における一致を示す。 簡易法およびディスク法は、参照法と比較して100および99％の陽性を示したが、この割合はAPIブドウ球菌システムでは84％であった。 APIブドウ球菌法による同定の不一致を有する16種の分離株のうち、10種（62.,5％）は正しい識別を示したが、％IDは7.1から31％で、許容値よりも低かった。
二段階で行われた簡易法は、ＣＮＳ種の同定の点で参照法と異ならなかった。 他の方法とは対照的に、ディスク法は不正確な同定を示し、誤ってS.capraeとしてこの株の分類につながる、ディスク上のスクロースの非発酵によるS.hominis株（6.5％） 他の種については不一致は認められなかった。, 1s.epidermidis株（S.lugdunensisとして同定された）、3S.haemolyticus株（2s.aureusとして同定され、1s.hominisとして同定された）、4S.hominis株（2S.lugdunensisとして同定され、1S.haemolyticusとして同定され、1s.aureusとして同定された）、8S.warneri株（3S.lugdunensisとして同定され、2S.haemolyticus、s.hominisとして2、およびs.saprophyticusとして1）（表iii）。, ＣＮＳは、血液培養物から最も一般的に単離された微生物であり、多くの発展途上国において深刻な健康問題を表し、また開発された（Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． 1995). いくつかの研究では、s.epidermidisと院内感染（Vuong&Otto2002）との関連が示唆されており、この種はCNSによって引き起こされる細菌症患者の74-92％で同定されている（Martin et al. 1989). しかしながら、他の研究では、他のＣＮＳ種によって引き起こされる一連の感染が報告されている（Herwaldt et al. 1996年）、主にS., 次に最も頻繁に検出された種であるhaemolyticus（Bannerman2003）。 CNSは一連の感染プロセスの病因であるため、これらの微生物の同定は、その生理病理学的特徴および臨床的重importanceの決定および疫学的研究にとって重要であり、これらの細菌の同定方法を分析する様々な研究の出版につながっている（Knapp&Washington1989,Bannerman et al. 1993,Piccolomini et al. 1994,Renneberg et al. 1995,Ieven1995,De Paulis et al. 2003).,
本研究では、私たちの研究室で修正された方法は、参照法と比較してCNS種の正しい分類の点で良好な結果をもたらし、簡易修正法では100％の一致、ディスク法では99％の一致が観察された。
ここで提案された同定sche-meを用いた簡易法（図）は、s.epidermidis、S.hominis、S.xylosus、S.capitis、およびS.simulansを単一ステップで同定することにつながった。, S.epidermidisは最も頻繁に単離される種であるため、臨床検査で単離された株の70-90％（Bannerman2003）は、減らされた数の試験を用いて同定することができる。
インキュベーション時間に関して、結果は、研究で分析された株の91％が48℃でインキュベーションの37時間以内に種特異的糖を発酵させたことを示した。, 他の株（9％）は、インキュベーションの72時間後に与えられた糖の発酵のために陽性をテストし、正しくこれらの微生物を同定するために、少なくとも72時間の糖発酵試験のインキュベーションの重要性を実証した。 Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ，Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ亜種ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ，Ｓ．ｃａｐｒａｅ，Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ，Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓおよびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの同定には，簡易法の第一段階で得られた結果に応じて変化する第二段階と呼ばれる二つまたは三つの追加生化学試験を行う必要があった。, しかし、それらの同定のための第二段階を必要とする20（37.7％）株は、このように追加のテストの前の継続を可能にし、24時間以内にトレハロースを発酵させ これらの種の同定に必要な第二段階は、結果が48時間後にのみ利用可能である硝酸還元試験を含んでいたので、S.cohnii、S.schleiferi亜種schleiferi、およびS.capraeを同定するために長い時間が必要であったが、臨床サンプル中のこれらの種の頻度が低いため、実際にはCNSの診断が遅れることはなかった。, また，ディスク法は糖類の事前調製を必要とせず，培地の損失を防止し，参照法とＣＮＳの同定において高い一致を示すことから，高効率で実用的であることが分かった。
市販のAPIブドウ球菌キットは、研究された方法の中でCNSの同定において最も低い精度を示した（84％一致）（Bannerman et al. 1993,Renneberg et al. 1995).
S.warneriおよびs.hominisは同定が最も困難な種であった。 Bannerman et al., (1993)はまた、これらの種の同定における精度が低いことを報告した。 Ievenらの研究では。 (1995)によると、S.hominisはAPI ID32ブドウ球種システムによって最も精度が低いと同定された。 この知見は，ノボビオシン抵抗性，チオグリコール酸塩中の嫌気性成長および溶血素産生などの相補的試験の欠如によって説明されると考えられる。 Sの場合は
Sの場合は
Sの場合は, ＡＰＩブドウ球菌システムによる誤った同定は，キットが相補的な試験として溶血素産生を示唆していないことによって説明できると考えられ，これはＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ株の同定に不可欠である。
APIブドウ球菌システムによって分析された3％の100株のうち、s.aureusと同定され、rennebergらによっても報告された事実である。 (1995). キットはs.aureusの同一証明のための基本的で、最も広く受け入れられたテストの結果を要求しなかったのでこれらのケースで非能率的であるために,、コアグラーゼ試験（Ｋｏｎｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． 1997). Ｐｉｃｃｏｌｏｍｉｎｉらによれば、これらの研究によると、これらの研究によると、 (1994)では、APIブドウ球菌とCNSの同定のための伝統的な生化学試験との間の低い一致は、異なるインキュベーション時間、基質濃度および/または感度マーカーの使用によって説明することができる。, 結果として，本研究室で修正した二つの方法は，基準法に比べて感度と特異性が高く，試験が少なく，標準法よりも経済的で速いことに加えて，ルーチン使用に対して非常に効率的であることが分かった。 短いインキュベーション時間（18時間）を必要とするにもかかわらず、APIブドウ球菌システムは、いくつかの種の同定に低い感度を示した。, 間違いなく、CNS種の同定は、特に限られた資源を持つ場所で、シンプルで安価で正確な手順の可用性によって促進され、奨励されるでしょう。
謝辞
本研究で使用されたAPIブドウ球菌キットの寄付のためのbioMérieuxへの。
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