혈구계
를 사용하여 세포를 계수하는 그림 1. 혈구계 격자선.
계산에 사용되어야하는 16 개의 사각형 세트 중 하나를 나타내는 혈구계 다이어그램.
세미나본
셀을 계산할 수 있습의 정확한 결정은 핸드폰 번호,따라서,간의 일관성을 실험을 합니다. 이 비디오는 혈구계를 사용하여 현탁액과 부착 세포를 모두 세는 절차를 간략하게 설명합니다.
작업을 시작하기 전에 층류 안전 캐비닛 내부를 소독제로 철저히 분무하고 티슈로 깨끗이 닦으십시오., 사용 된 티슈를 적절한 쓰레기통에 버리십시오. 다음으로 70%에탄올로 후드 내부를 스프레이하고 티슈로 깨끗하게 닦으십시오. 후드는 이제 깨끗하고 사용할 준비가되었습니다. 냉장고에서 세포 배양 배지와 트립신을 제거하고 가습 된 37 도 C 의 이산화탄소 배양기에 넣어 따뜻하게하십시오. 한편,박테리아 및 곰팡이 오염의 시각적 징후를 확인하기 위해 현미경을 사용하여 계산 될 세포를 살펴보십시오. 층류 안전 캐비닛에서 연주하기 전에 70%에탄올로 미디어 병과 피펫을 스프레이하십시오.,
현탁 세포의 경우 플라스크를 부드럽게 교반하여 세포가 잘 혼합되도록하십시오. 그들이 정착 할 기회를 얻기 전에 0.5 밀리리터의 세포 현탁액 샘플을 채취하고 피펫을 멸균 된 eppendorf 튜브에 넣습니다. 부착 세포의 경우 기존 매체를 제거하고 실온 PBS 로 세척하고 트립신 EDTA 를 추가하여 세포를 분리하십시오. 필요한 PBS 및 트립신의 양은 표 1 을 참조하십시오. 가습 된 37 도 C,이산화탄소 배양기에서 2~5 분 동안 세포를 배양하십시오. 배양 시간은 세포 유형에 맞게 최적화되어야 할 것이다., 모든 세포가 분리되면 트립신 EDTA 를 세포 및 배양에 적합한 성장 배지를 함유하는 따뜻한 혈청으로 중화시킨다. 필요한 볼륨은 표 1 을 참조하십시오.
세포 현탁액을 세 번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재 현탁시키고 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 실온에서 분당 1,000 회전에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리한다., 제 상등액을 사용하여 멸균 혈 청 학적인 피펫과 다시 정지시킬 세포트 37 도 C 세럼을 포함하는 성장 미디어 원래의 볼륨을 시작하는 문화입니다. 5 밀리리터의 멸균 피펫을 사용하여 0.5 밀리리터의 세포 현탁액 샘플을 채취하고 멸균 된 eppendorf 튜브로 옮깁니다.
세는 것에,처분할 수 있는 hemocytometer 를 준비하십시오. P2000Gilson 피펫을 사용하여 100 마이크로 리터의 서스펜션을 취하고 400 마이크로 리터의 trypan blue 에 추가하십시오.08%잘 섞는다., 100 마이크로 리터의 trypan blue 셀 현탁액을 혼합,그리고 신중하게 간접 드롭의 현탁액으로의 잘 계산하실 수 있도록 모세관 작업을 그릴에서 샘플. 카운팅 챔버를 과도하게 채우지 않도록주의하십시오. 거꾸로 된 현미경을 사용하여 10 배 배율로 계산 영역을 봅니다. 현미경을 사용하여 혈구계에 4 개의 그리드 중 하나에 초점을 맞추고 트리판 블루에 대해 음수로 세포를 계산합니다. 이 것들은 실행 가능합니다. 또한 트리판 블루에 대해 얼마나 많은 세포가 양성 이었는지 기록하십시오., 이 세포들은 죽었고,이 숫자는 나중에 필요할 경우 배양 물의 백분율 생존력을 계산하는 데 사용될 수 있습니다.
셀 때 그들은 사각형 내에서,또는 오른쪽 손 또는 하단 경계 선에 셀만 계산 됨으로써 시스템을 사용 합니다. 레코드 수를 세포의 계산에 이의 세트 16 제곱과 이동 hemocytometer 까지 모든 네트 16 에 사각형 hemocytometer 되었을 계산하고,자신의 값이 기록됩니다., 셀을 계산하는 집중력,평균을 수의 실행 가능한 세포에서 네트 16 제곱와 곱하여 10,000 명의 수를 얻기 위하여 세포의 밀리리터 당. 그런 다음 이것을 5 로 곱하여 트리판 블루 추가에서 5 개의 희석 중 하나를 수정하십시오. 이 최종 값은 원래 세포 현탁액에서 밀리리터 당 생존 가능한 세포의 수입니다.,
경우,예를 들어,당신의 가능한 세포수가 200,000 세포당 밀리리터에서의 볼륨 20 밀리리터이고 당신이보고 싶은 10,000 세포로 새로운 플라스크,그 후 필요하신 전송 50 마이크로 리터의 서스펜션으로 새로운 플라스크. 필요한 부피의 세포 현탁액을 새 플라스크에 옮깁니다. 미디어로 위로 올려 인큐베이터에 넣으십시오.