metoder for identifisering av coagulase-negative stafylokokker

BIOKJEMISK KARAKTERISERING

Sammenligning av metoder for identifisering av coagulase-negative stafylokokker

Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII

IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil

ABSTRAKT

Coagulase-negative stafylokokker (CNS) artsidentifisering er fortsatt vanskelig for de fleste kliniske laboratorier., Ordningen er foreslått av verdens nest største og Schleifer og endres av Bannerman er referansemetoden som benyttes for identifisering av stafylokokk arter og underarter, men denne metoden er relativt arbeidskrevende for rutinemessig bruk siden det krever utnyttelse av et stort antall av biokjemiske tester. Målet med denne studien var å sammenligne de fire metoder, dvs., referansemetoden, API Staph system (bioMérieux) og to metoder modifisert fra referanse metode i vårt laboratorium (forenklet metode og disk metode), i identifisering av 100 CNS-stammer., I forhold til referansemetoden, forenklet metode og disk metode riktig identifisert 100 og 99% av CNS arter, henholdsvis, mens denne prisen var 84% for API Staph system. Feilaktig identifisering av API Staph metoden ble observert for Staphylococcus epidermidis (2.2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37.5%), og S. warneri (47.1%)., Forenklet metode som bruker enkel identifisering ordningen som foreslås i denne studien ble funnet for å være effektiv for alle stammer testet, med 100% sensitivitet og spesifisitet, og viste seg å være tilgjengelige alternativ for identifikasjon av stafylokokker, tilbud, høyere pålitelighet og lavere kostnad enn tilgjengelig for øyeblikket kommersielle systemer. Denne metoden ville være svært nyttig i klinisk mikrobiologisk laboratorium, spesielt på steder med begrensede ressurser.,

stikkord: coagulase-negative stafylokokker – metoder – identifisering – API Staph

Førti arter av slekten Staphylococcus har blitt identifisert så langt (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, en coagulase-positive arter som produserer en rekke andre enzymer og giftstoffer, er best kjent og har vært hyppig involvert i etiologien av en rekke infeksjoner og intoxications i dyr og mennesker, mens coagulase-negative stafylokokker (CNS), som representerer flertallet av arter, har vært ansett for å være saprophytic sjelden eller patogene (verdens nest største & Schleifer 1975)., Over det siste tiåret, men CNS har blitt anerkjent som den etiologiske agenter for en rekke smittsomme prosesser, som representerer mikroorganismer som oftest isolert fra blod kulturer (Huebner & Goldmann 1999).

Om lag halvparten av CNS arter naturlig kolonisere mennesker, og i dag regnes de i hovedsak opportunistiske etiologiske agenter, som gjelder i en rekke økologiske situasjoner for å produsere alvorlige infeksjoner (Bannerman 2003)., Fremveksten av CNS som patogener av ulike infeksjoner kan være et resultat av økt bruk av invasive prosedyrer som intravaskulært kateter og proteser hos pasienter under intensiv behandling, immunsupprimerte pasienter, premature barn, pasienter med neoplasias, og transplantasjon pasienter (verdens nest største & Bannerman 1994).

De artene som oftest føre til sykdommer hos mennesker S., epidermidis (bakterier, infeksjoner på grunn av implantert medisinsk utstyr, for eksempel proteser og katetre, infeksjon av kirurgiske sår, peritonitis hos pasienter på kontinuerlig peritoneal dialyse, osteomyelitt, endophthalmitis etc.), S. haemolyticus (endokarditt, peritonitis, septikemi, og infeksjoner i urin-område, sår, bein og ledd), og S. saprophyticus (urin-infeksjoner og septicemic prosesser). Andre viktige opportunistiske patogener inkluderer S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus, og S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis ser ut til å være assosiert med endokarditt etter implantasjon av protese ventiler, med peritonitis, med bløtvev infeksjoner, og med ryggvirvel osteomyelitt (Osmon et al. 2000).

I lys av de kjente patogene potensialet i CNS innen sykehuset miljø, interesse om utvalg av arter knyttet til infeksjon og deres toxigenic potensial og virulence har økt det siste tiåret, og har ført til utgivelsen av ulike studier på disse aspektene., Imidlertid, til tross for den økende karakterisering av CNS-infeksjoner, disse mikroorganismene er ikke identifisert i klinisk mikrobiologi laboratorier. Ordningen er foreslått av verdens nest største og Schleifer (1975) og modifisert av Bannerman (2003) er den metoden som brukes konvensjonelt, men denne metoden er relativt arbeidskrevende for rutinemessig bruk siden et stort antall av biokjemiske tester er nødvendig., I de fleste laboratorier rutine, stafylokokker er identifisert basert på morfologiske aspekter av koloniene, gram-farging og catalase og coagulase-produksjon, som bare tillater klassifisering av stafylokokker i S. aureus og ikke-S. aureus-isolater, med sistnevnte bare blir klassifisert som CNS.

utvikling av metoder for identifisering av stafylokokk arter og underarter som tillater klinikere til å innhente informasjon om utvalg av CNS stede i kliniske prøver og til å betrakte dem som etiologiske agenter av smittsomme prosesser., Nøyaktig identifikasjon av CNS er nødvendig for å ha en tidlig prediksjon av potensielle pathogenicity eller antibiotika mottakelighet for hver klinisk isolere og å avklare den kliniske betydningen av hver art. Gjenta CNS-isolater fra pasienter med invasiv sykdommer bør identifiseres for å tillate en sammenligning av spenninger. På den annen side, arter identifikasjon er en forutsetning for å skrive prosedyrer for epidemiologiske studier er foretatt.,

I de siste årene, flere kommersielle systemer for rask identifikasjon av stafylokokker har blitt utviklet som et alternativ til den klassiske identifikasjon protokoller (Bannerman 2003). Imidlertid, disse diagnostiske systemer gir problemer for eksempel kost og inkubasjonstid, ofte gi upålitelige resultater (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). I tillegg, mange av disse pakkene ble utformet for identifisering av alle kjente CNS-arter (dvs., kliniske, veterinær, og alimentary isolater), og dermed er ikke veldig konkret., Basert på ovennevnte vurderinger, og i lys av behovet for en rask, enkel og pålitelig metoder målet med denne studien var å sammenligne de fire teknikker for identifisering av CNS, dvs., en referanse metode (verdens nest største & Schleifer 1975, Bannerman 2003), den kommersielle API Staph system, og to metoder modifisert fra referanse metode i vårt laboratorium for å utvikle alternative metoder for identifikasjon kombinerer enkelhet, pålitelighet og lave kostnader, spesielt til steder med begrensede ressurser.,

MATERIALER OG METODER

Isolater – Ett-hundre CNS-isolater hentet fra kliniske prøver av pasienter innlagt på universitetssykehuset det medisinske Fakultet, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu Campus, ble studert. Stammer som ble isolert som beskrevet av Koneman et al. (1997).

Identifisering av CNS – Den isolerer hentet fra kliniske prøver ble belagt på blodagar og gram farget for å garantere sin renhet og bevaring av deres morfologi og bestemte flekker., Etter bekreftelse av disse egenskapene, er det isolater ble sendt til catalase og coagulase-tester. Staphylococcus ble skilt fra Micrococcus arter på grunnlag av oksidasjon og fermentering av glukose, motstand mot bacitracin (0.04 U), indikert ved fravær av en hemming halo eller tilstedeværelse av en hemming halo måler opp til 9 mm i diameter, og mottakelighet for furazolidone (100 µg) preget av hemming soner måler 15 til 35 mm i diameter (Baker 1984).

De fire metodene som er beskrevet nedenfor ble brukt for identifisering av CNS., Følgende internasjonale referanse CNS stammer ble brukt som kontroller: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), og S. saprophyticus (ATCC 15305).,

Referanse metode foreslått av verdens nest største og Schleifer (1975) og Bannerman (2003) – Denne metoden består av et sett av biokjemiske tester som bestemmer bruken av sukker xylose, arabinose, sukrose, trehalose, maltose, mannitol, laktose, xylitol, ribose, fruktose, og mannose, produksjon av hemolysin, nitrat reduksjon, tilstedeværelse av urease og ornithine decarboxylase, og motstand mot novobiocin preget av en hemming halo opp til 16 mm. Målinger av testene ble oppnådd etter 24, 48 og 72 timers inkubering ved 37ºC i en inkubator.,

API Staph – API Staph system (bioMérieux) er klar-til-bruk testbatteri bestående av 20 biokjemiske tester som en homogen bakteriell suspensjon på 0,5 McFarland turbiditet er lagt til. Etter 24 timers inkubering ved 37ºC og tillegg av VP (VP1 og VP2), NIT (NIT1 og NIT2) og PAL (ZYM EN og ZYM B) reagenser som følger med settet, og reaksjonene ble tolket og mikroorganismer ble identifisert ved hjelp av analytiske katalog., Identifiseringen er basert på en numerisk system som består av sju sifre som gir prosent identification (%- ID), med en verdi på > 80% å være akseptabelt.

Endret metoder – To metoder for identifikasjon endret i vårt laboratorium ble brukt (forenklet metode og disk metode). Den forenklede metoden ble delt inn i to trinn. I løpet av de første trinn, gjæring av xylose, sukrose, trehalose, maltose, og mannitol, produksjon av hemolysin, og anaerob vekst i tioglykolat ble testet (Tabell I)., Testene som brukes i det andre trinnet varierte i henhold til de resultatene som er oppnådd i første identifisering trinn etter 72-timers inkubering ved 37ºC. Supplerende tester som brukes i trinn to (hvis nødvendig), er angitt i Tabell II.

disken metoden besto av følgende tester: gjæring av arabinose, sukrose, trehalose, maltose, mannitol og laktose, nitrat reduksjon, produksjon av hemolysin tester for urease og ornithine decarboxylase, og motstand mot novobiocin., For sukker gjæring test, kommersielt tilgjengelige disker som er spesifikke for hver sukker ble lagt i rør som inneholder 2,5 ml Lilla Buljong Base medium. Bakteriell suspensjoner var inokulert som beskrevet av verdens nest største og Schleifer (1975). Målinger for de to metodene ble innhentet etter 24, 48 og 72 timers inkubering ved 37ºC, og CNS arter som ble identifisert i henhold til identifisering ordningen som er foreslått i Figuren.,

Statistisk analyse for Å fastslå graden av enighet mellom de metoder som brukes for identifisering av CNS (forenklet metode, disk metode og API Staph) og referansemetoden (verdens nest største & Schleifer 1975, Bannerman 2003), sensitivitet og spesifisitet av tester (Sox 1986) ble vurdert som følger.,

Følsomhet: andel av CNS stammer som testet positivt for en bestemt art av referansemetoden og som ble identifisert som de samme artene av metode analysert (forenklet metode, disk eller API Staph).

Spesifisitet: andel av CNS stammer som testet negativt for en bestemt art av referansemetoden og som også var negative for de samme artene når testet av metoden som er analysert (forenklet metode, disk eller API Staph).

RESULTATER

100 stafylokokk-isolatene ble testet av de fire foreslåtte metoder., Resultatene som oppnås med referansemetoden (verdens nest største & Schleifer 1975, Bannerman 2003) ble sammenlignet med de som oppnås med den endrede metoder og API Staph system.

Tabell III viser til avtalen i identifikasjon mellom analysert analyser og referansemetoden. Forenklet metode og disk metoden viste 100 og 99% positivitet i forhold til referansemetoden, mens denne andelen var 84% for API Staph system. Av de 16 isolater med uenighet om identifisering av API Staph metode, 10 (62.,5%) viste korrekt identifisering men med en % – ID på 7,1 til 31%, som er lavere enn det akseptable verdi.

forenklet metode gjennomført i to trinn ikke skiller seg fra referansemetoden i form av identifisering av CNS arter. I motsetning til andre metoder, disk metoden viste feilaktig identifisering og feilaktig identifisert en S. hominis belastning (6.5%) på grunn av den ikke-gjæring av sukrose på disken, som fører til klassifisering av denne belastningen som S. caprae. Ingen uoverensstemmelser ble observert for andre arter.,

Den største avviket ble observert mellom referansemetoden og API Staph system, med sistnevnte metode ikke nøyaktig identifiserer 1 S. epidermidis belastning (identifisert som S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus stammer (2 identifisert som S. aureus og 1 som S. hominis), 4 S. hominis stammer (2 identifisert som S. lugdunensis, 1 S. haemolyticus og 1 som S. aureus), og 8 S. warneri belastning (3 identifisert som S. lugdunensis, 2 S. haemolyticus, 2 som S. hominis og 1 som S. saprophyticus) (Tabell III).,

DISKUSJON

CNS er mikroorganismer som oftest isolert fra blod kulturer, noe som representerer en alvorlig helseproblem i mange utviklingsland, og også utviklet (Renneberg et al. 1995). Noen studier har antydet en sammenheng mellom S. epidermidis og nosokomiale infeksjoner (Vuong & Otto 2002) med denne arten blir identifisert i 74 92% av pasienter med bacteremias forårsaket av CNS (Martin et al. 1989). Men andre studier har rapportert en rekke infeksjoner forårsaket av andre CNS-arter (Herwaldt et al. 1996), hovedsakelig S., haemolyticus, som er den nest hyppigst påvist arter (Bannerman 2003). Siden CNS er den etiologiske agenter for en rekke smittsomme prosesser, identifisering av disse mikroorganismene er viktig for fastsettelse av deres physiopathological egenskaper og klinisk betydning, og for epidemiologiske studier, og har ført til utgivelsen av ulike studier for å analysere identifikasjon metoder for disse bakteriene (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, De Paulis et al. 2003).,

I denne studien, metodene som er endret i vårt laboratorium har gitt gode resultater i form av riktig klassifisering av CNS arter i forhold til referansemetoden, med 100% – avtalen blir observert for forenklet modifisert metode og 99% – avtalen for disk-metoden.

forenklet metode ved hjelp av identifisering ordningen som foreslås her (Figur) førte til identifisering av S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis, og S. simulans i ett enkelt trinn, ved hjelp av en total av syv biokjemiske tester, et tall lavere enn det som er ansatt i referansemetoden (16 tester)., Siden S. epidermidis er den hyppigst isolerte arter, 70 til 90% av stammene (Bannerman 2003) isolert i kliniske laboratorier, kan identifiseres ved hjelp av et redusert antall tester.

Med hensyn til inkubasjonstid, resultatene viste at 91% av stammer analysert i studien gjæret arter-spesifikke sukker innen 48 timers inkubering ved 37ºC., Det andre stammer (9%) testet positivt for gjæring av gitt sukker etter 72 timers inkubering, demonstrerer viktigheten av en inkubering av sukker gjæring tester av minst 72 h for å identifisere disse mikroorganismen.

identifisering av S. cohnii, S. schleiferi underarter schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus, og S. lugdunensis kreves gjennomføring av to eller tre andre biokjemiske tester, referert til som den andre trinn, som varierte i henhold til resultatet som ble oppnådd i første trinn av en forenklet metode., Imidlertid, 20 (37.7%) stammer som kreves det andre trinnet for deres identifisering gjæret trehalose innen 24 h, og dermed tillater før videreføring av ytterligere tester. En lengre tid var nødvendig for å identifisere S. cohnii, S. schleiferi underarter schleiferi og S. caprae, siden det andre trinnet kreves for identifisering av disse artene omfattet nitrat reduksjon test hvis resultatet er bare tilgjengelig etter 48 t. Men, dette faktum gjør faktisk ikke føre til forsinkelse i diagnostikk av CNS siden hyppigheten av disse artene i kliniske prøver er lav.,

disken metoden ble også funnet å være svært effektiv og praktisk siden den ikke krever forberedelse av sukker, og dermed hindre tap av kultur, media, i tillegg til å nå høye avtalen i identifisering av CNS med referansemetoden.

Den kommersielle API Staph kit viste den laveste nøyaktighet i identifisering av CNS blant de metodene som er studert (84% – avtalen), i samråd med studier av (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995).

S. warneri og S. hominis, var mest vanskelig art å identifisere. Bannerman et al., (1993) rapporterte også lavere nøyaktighet i identifisering av disse artene. I studiet av Ieven et al. (1995), S. hominis ble identifisert med minst nøyaktighet ved API ID 32 Staph system. Dette funnet kan forklares med mangel på utfyllende tester som novobiocin motstand, anaerob vekst i tioglykolat og hemolysin produksjon.

I tilfelle av S., haemolyticus, feil identifisering av API Staph systemet, kan forklares med det faktum at settet ikke foreslå hemolysin produksjon som en utfyllende test, som ville være avgjørende for identifisering av S. haemolyticus stammer.

Tre (3%) av de 100 stammer analysert av API Staph systemet ble identifisert som S. aureus, et faktum som også rapportert av Renneberg et al. (1995). Settet ble funnet å være ineffektiv i disse tilfellene, siden det gjorde ikke be om resultatet av den grunnleggende og mest aksepterte test for identifisering av S. aureus, dvs., det coagulase-test (Koneman et al. 1997).

Ifølge for å Piccolomini et al. (1994), den lave avtalen mellom API Staph og den tradisjonelle biokjemiske tester for identifisering av CNS kan forklares ved bruk av ulike inkubasjonstidene, substrat konsentrasjoner og/eller følsomhet markører.,

I konklusjonen, to metoder endret i vårt laboratorium ble funnet å være svært effektiv for rutinemessig bruk på grunn av sin høye følsomhet og spesifisitet i forhold til referansemetoden, i tillegg til å kreve færre tester og dermed være mer økonomisk og raskere enn standard metode. Til tross krever en kortere inkubasjonstid (18 t), API Staph systemet viste en lavere følsomhet i identifisering av arter., Utvilsomt, CNS identifisere arter vil være facilited og oppmuntret av tilgjengeligheten av en enkel, billig, og nøyaktig prosedyre, spesielt på steder med begrensede ressurser.

ERKJENNELSENE

for Å bioMérieux for donasjon av API Staph kits som brukes i denne studien.

Baker JS 1984. Sammenligning av ulike metoder for differensiering av stafylokokker og micrococci. J Clin Microbiol 19: 875-879.

Bannerman TL 2003. Staphylococcus, Micrococcus og andre catalase-positive cocci som vokser aerobt., I PR-Murray, EJ Baron, JH Jørgensen, MA Pfaller, RH Yolken (red), Manuell for Klinisk Mikrobiologi, Amerikanske Samfunnet Microbiology, Washington, s. 384-404.

Bannerman TL, Kleeman KT, verdens nest største VI 1993. Evaluering av Vitek Systemer Gram-positive id-kort for artsidentifisering av coagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 31: 1322-1325.

De Paulis EN, Predari S, Chazarreta CD, Santoianni JE 2003. Fem-test enkel ordning for arter-nivå identifisering av klinisk signifikant coagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 41: 1219-1224.,

Gi CE, Sewell DL, Pfaller M, Bumgardner BOBILER, Willians JA 1994. Evaluering av to kommersielle systemer for identifikasjon av coagulase-negative Stafylokokker å arter nivå. Diag Microbiol Infisere Dis 18: 1-5.

Herwaldt LA, Geiss M, Kao C, Pfaller M 1996. Den positive verdien av å isolere coagulase-negative stafylokokker fra blod kulturer. Clin Infisere Dis 22: 14-20.

Huebner J, Goldmann DA 1999. Coagulase-negative stafylokokker: rolle som patogener. Annu Rev Med 50: 223-236.

Ieven M, Verhoeven J, Pattyn SR, Goossens H 1995., Rask og økonomisk metode for å identifisere arter av klinisk signifikant coagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 33: 1060-1063.

verdens nest største VI, Bannerman TL 1994. Oppdatering på kliniske betydningen av coagulase-negative stafylokokker. Clin Microbiol Rev 7: 117-140.

verdens nest største VI, Schleifer KH 1975. Forenklet ordning for rutinemessig identifisering av menneskelig Staphylococcus arter. J Clin Microbiol 1: 82-88.

Button CC, Washington JA 1989., Evaluering av trehalose-mannitol buljong for differensiering av Staphylococcus epidermidis fra andre coagulase-negative stafylokokk arter. J Clin Microbiol 27: 2624-2626.

Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC 1997. Color Atlas og Lærebok av Diagnostiske Mikrobiologi, 5. utg., Lippincott, Philadelphia, 1395 pp.

Kwok AYC, Chow AW 2003. Fylogenetisk studie av Staphylococcus og Macrococcus arter basert på delvis hsp60 gensekvenser. Int J Syst Evol Microbiol 53: 87-92.

Martin MA, Pfaller MA, Wenzel RP 1989., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern Med 110: 9-16.

Osmon DR, Sampathkumar P, Cockerill FR 2000. Prosthetic joint infection due to Staphylococcus lugdunensis. Mayo Clinic Proceedings 75: 511-512.

Perl TM, Rhomberg PR, Bale MJ, Fuchs PC, Jones RN, Koontz FP, Pfaller MA 1994. Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diag Microbiol Infect Dis 18: 151-155.

Piccolomini R, Catamo G, Picciani C, D»Antonio D 1994., Evaluering av Staph-System 18-R for identifisering av stafylokokk kliniske isolater til arter nivå. J Clin Microbiol 32: 649-653.

Renneberg J, Rieneck K, Gutschik E 1995. Evaluering av Staph ID-system og Staph Zym system for identifisering av coagulase-negative stafylokokker. J Clin Microbiol 33: 1150-1153.

Sox HC 1986. Sannsynlighetsteori i bruken av diagnostiske tester. En introduksjon til kritisk studie av litteratur. Ann Intern Med 104: 60-66.

Trülzsch K, Rinder H, Trèek J, Bader L, Wilhelm U, Heesemann J 2002., «Staphylococcus pettenkoferi», a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diag Microbiol Infect Dis 43: 175-182.

Vuong C, Otto M 2002. Staphylococcus epidermidis infections. Microb Infect 4: 481-489.

---