Telle celler ved hjelp av en hemocytometer
Figur 1. Hemocytometer rutenett.
Hemocytometer diagrammet som indikerer at ett av settene med 16 ruter som bør brukes for å telle.
Webinar-transkript
Telle celler kan nøyaktig bestemmelse av celle tall, og derfor er det konsistens mellom eksperimenter. Denne videoen vil skissere fremgangsmåten for å telle både fjæring og overholdelse av cellene ved hjelp av en hemocytometer.
Før du starter arbeidet, grundig spray innsiden av laminær sikkerhet skap med desinfeksjonsmiddel og tørk ren med en klut., Kast brukte vevet i det aktuelle avfallsdunken. Neste, spray innsiden av hetten med 70% etanol og tørk ren med en klut. Panseret er nå ren og klar til bruk. Fjern celle kultur, media og trypsin fra kjøleskapet, og plasser det i en humidified, 37 grader C, karbondioksid inkubator for varm. I mellomtiden, se på cellene til å bli regnet ut ved hjelp av et mikroskop for å se etter noen visuelle tegn på bakteriell og fungal forurensning. Spray media flasker og pipetter med 70% etanol før du spiller i laminær sikkerhet skap.,
For suspensjon celler, forsiktig rist kolben for å sikre at cellene er godt blandet. Før de får en sjanse til å avgjøre, ta en 0.5 milliliter eksempel cellesuspensjon og pipetter i et sterilt eppendorf-rør. For tilslutning celler, fjerne eksisterende media, vask med romtemperatur PBS, og legge til trypsin EDTA å koble celler. Se Tabell for volumer av PBS og trypsin nødvendig. Inkuber celler for to til fem minutter i humidified 37 grader C, karbondioksid inkubator. Inkubasjonstiden må være optimalisert for cellen., Når alle cellene er frittliggende, nøytralisere trypsin EDTA med varme serum som inneholder vekst media egnet til cellene og kultur. Se Tabell for de nødvendige volumer.
resuspensjon av cellene ved å forsiktig pipettering cellesuspensjon opp og ned tre ganger, og overføre dem til en 50 milliliter rør. Sentrifuger cellesuspensjon for fem minutter på med 1000 omdreininger per minutt ved romtemperatur., Fjern supernatanten ved hjelp av en steril serologiske pipetter og resuspensjon av cellen palett med 37 grader C serum som inneholder vekst media til den opprinnelige volumet på start-kultur. Ved hjelp av en fem milliliter sterilt pipetter, ta og 0,5 milliliter eksempel cellesuspensjon, og overføre dem til en steril eppendorf-rør.
Å være telle, forberede disponibel hemocytometer. Ved hjelp av en P2000 Gilson Pipetter, ta 100 microliters av suspensjon, og legge til 400 microliters av trypan blå, notat .08% og bland godt., Ta 100 microliters av trypan blå cellesuspensjon blanding, og nøye pipetter en dråpe av suspensjon i godt av å telle kammer, slik at kapillarkrefter å trekke utvalget på. Ta forsiktighet for ikke å overfylle telle kammeret. Vise telle område under 10 ganger forstørrelse ved hjelp av en invertert mikroskop. Ved hjelp av mikroskop, fokusere på en av fire av fire nettene på hemocytometer og telle celler i en negativ for trypan blå. Disse meldingene er levedyktig. Også, må du merke av hvor mange celler som var positive for trypan blå., Disse cellene er døde, og dette nummeret kan brukes senere til å beregne hvor stor andel levedyktighet av kultur hvis det er nødvendig.
Ved å telle, benytter et system hvor cellene telles bare når de er i en firkant, eller på høyre eller nederst grenselinjen. Noter antall celler regnet med i dette settet av 16 kvadrater og flytte hemocytometer til alle fire sett av 16 kvadrater på hemocytometer har vært regnet, og deres verdier som er registrert., For å beregne konsentrasjonene, ta gjennomsnittlig antall levedyktige celler i fire sett med 16 ruter og multiplisere med 10 000 for å få det antall celler per milliliter. Deretter multiplisere denne med fem til rette for den i fem fortynning fra trypan blå tillegg. Dette siste verdien er antall levedyktige celler per milliliter i den opprinnelige cellen suspensjon.,
For eksempel, hvis din levedyktig celletall er over 200 000 celler per milliliter i et volum på 20 milliliter og du vil se 10.000 celler til den nye kolben, så du trenger til å overføre 50 microliters av din cellesuspensjon til ny kolbe. Overføre nødvendig volum av cellesuspensjon til ny kolbe. Topp opp med media og sette inn i inkubatoren.