anksjolityczne działanie olejku bergamotowego jest niewrażliwe na Flumazenil u szczurów

Streszczenie

Zaburzenia lękowe są jednym z najczęstszych zaburzeń psychicznych, a benzodiazepiny (BDZs), działające na kompleks receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A (GABA-A), stanowią najczęstsze leki przeciwlękowe na świecie. Jednak przewlekłe stosowanie BDZ wywołuje kilka działań niepożądanych. Podobno aromaterapia jest bezpieczniejsza w zarządzaniu lękiem., Olejek bergamotowy (BEO) ekstrahowany z owoców cytrusowych bergamia Risso et Poiteau, podobnie jak inne olejki eteryczne, jest szeroko stosowany w aromaterapii w celu złagodzenia objawów lęku wywołanego stresem. Co ciekawe, dane przedkliniczne wskazują, że BEO wywołuje działanie anksjolityczne / zwiotczające w zachowaniach zwierząt, które nie nakłada się na benzodiazepinowy diazepam. Aby lepiej wyjaśnić udział transmisji Gabaergicznej, w niniejszym badaniu przeanalizowano wpływ wstępnego leczenia flumazenilem (FLZ), antagonistą receptora benzodiazepinowego, na działanie BEO przy użyciu open-field task (OFT) u szczurów., Uzyskane dane wskazują, że FLZ nie wpływa znacząco na efekty behawioralne fitokompleksu. Wyniki te wskazują na brak nakładania się efektów behawioralnych BEO i BDZ, przyczyniając się do charakterystyki neurobiologicznego profilu olejku eterycznego pod kątem jego racjonalnego zastosowania w aromaterapii.

1. Wprowadzenie

kilka olejków eterycznych ekstrahowanych z owoców należących do rodzaju cytrusów stosuje się w aromaterapii w leczeniu lęku, snu, nastroju i zaburzeń poznawczych . Przypuszcza się, że bergamotka pochodzi z Citrus aurantium L. i Citrus limon L., albo Citrus aurantifolia Swing . Olejek eteryczny bergamotki (BEO) otrzymuje się przez tłoczenie na zimno epikarpa i częściowo mezokarpa świeżych owoców cytrusowych bergamia Risso et Poiteau, zgodnie z włoską Farmakopeą XII wyd. BEO zawiera frakcję lotną (93-96% całości) zawierającą utlenione pochodne (takie jak linalol) oraz węglowodory seskwiterpenowe i monoterpenowe (takie jak limonen) oraz frakcję nieulotną (4-7% całości) zawierającą polimetoksylowane flawony, woski, kumaryny i psoraleny, takie jak bergamottyna (5-geranyloxypsoralen) i bergapten (5-metoksypsoralen)., Limonen, γ-terpinen i β-pinen wraz z linalolem i octanem linalylu należą do najliczniejszych związków występujących we frakcji lotnej i wszystkie razem stanowią>90% całego oleju . W ostatniej dekadzie badania przedkliniczne potwierdziły terapeutyczne zastosowanie BEO. Szczególnie olejek bergamotowy charakteryzuje się niezwykłymi efektami neurobiologicznymi, częściowo wynikającymi z ingerencji w podstawowe mechanizmy precyzyjnego dostrajania plastyczności synaptycznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych, tj.,, niedokrwienie mózgu, ból oraz behawioralne i psychologiczne objawy demencji . W Warunkach podstawowych BEO podnosi pozakomórkowe poziomy dyskretnych aminokwasów z funkcją neuroprzekaźników po ogólnoustrojowym lub ogniskowym podaniu w hipokampie swobodnie poruszających się szczurów . Ponadto ogólnoustrojowe dawki BEO zwiększają korelację elektrokortykograficzną alarmu, czuwania i relaksu ., Zdolność BEO do zmiany częstości EEG, związanej z alarmem i relaksacją, wspiera dane wykazujące działanie przeciwlękowe i zwiotczające po ogólnoustrojowym lub wziewnym podaniu tego fitokompleksu w zadaniach behawioralnych zwierząt. Co ciekawe, uzyskuje się kontrowersyjne wyniki porównujące działanie BEO z działaniem diazepamu (DZP). W rzeczywistości, podczas gdy Saiyudthong i Marsden spekulują, że aktywne składniki fitokompleksu oddziałują z witryną BDZ na kompleks receptorowy GABA-A indukujący działanie anksjolityczne, niedawno udowodniliśmy, że właściwości BEO nie pokrywają się z działaniem DZP ., Ponieważ transmisja Gabaergiczna odgrywa kluczową rolę w patofizjologii zaburzeń lękowych, aby uzyskać lepszy wgląd w mechanizm działania Beo o działaniu anksjolitycznym, celem niniejszego badania jest zbadanie wpływu flumazenilu, antagonisty w miejscu wiązania BDZ, na zachowanie indukowane przez BEO w teście otwartego pola (OFT) u szczurów.

2. Materiały i metody

2.1., Zwierzęta

samce szczurów Wistar (250-300 g; Charles River, Calco, Włochy) trzymano w grupach po cztery w standardowych klatkach laboratoryjnych (40 × 25 × 15 cm) w stałej temperaturze (22 ± 1°C) i wilgotności względnej (50%) zgodnie z regularnym harmonogramem jasno-ciemnym (światła w godzinach 7.00-19.00). Przed częstym eksperymentem szczurom pozwolono na tydzień adaptacji do warunków laboratoryjnych z wolnym dostępem do żywności i wody. Dyrektywa Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG) i L. D. 4 marca 2014 r., Zastosowano 26, aby zminimalizować liczbę zwierząt, które nadal generują wiarygodne wyniki.

2.2. Materiały

2.3. Procedura eksperymentalna

aklimatyzację szczurów przeprowadzono przez 2 godziny w dniu eksperymentu. Zwierzęta zostały poddane habituacji. Utworzono losowe grupy eksperymentalne. Szczury zostały poddane dootrzewnowemu (IP) podaniu Beo (500 µL/kg) lub oleju jojoba . I. P. FLZ (3 mg / kg mc.), odwracając efekty BDZ w OFT, lub jego nośnik (tween w roztworze soli fizjologicznej) podawano jako leczenie wstępne 15 minut wcześniej., Po trzydziestu minutach oceniano efekty behawioralne za pomocą testu OF . Ten protokół eksperymentalny jest zgodny z danymi z literatury, w których wstępna obróbka FLZ przywraca efekty behawioralne różnych produktów naturalnych u wielu gryzoni .

szczura obserwowano z ekranu w pobliskim laboratorium, ponieważ badanie zostało zarejestrowane kamerą zamkniętą. Badania behawioralne przeprowadzono w godzinach 09.00 – 13.00, zgodnie z rytmem dobowym. Nagrania wideo zostały poddane poniższemu badaniu przez ślepego (nieświadomego zabiegów) obserwatora., Przedawkowanie izofluranu zostało użyte do eutanazji zwierzęcia po eksperymencie. Pomieszczenie było wentylowane, a arena była myta wodą i oczyszczona 70% etanolem po codziennych sesjach, aby uniknąć pozostałości zapachowych BEO i odchodów.

2.4., Test otwartego pola

Test otwartego pola jest uważany za wskaźnik stanu emocjonalnego zwierzęcia, który pozwala na łatwą i dość szybką ocenę dobrze zdefiniowanych zachowań, takich jak przekraczanie, odchowywanie ścian, pielęgnacja, centrum i unieruchomienie, i jest szeroko stosowany w badaniach przesiewowych leków działających na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) . W szczególności krzyżowanie się i wychowanie na ścianie można uznać odpowiednio za wskaźniki aktywności ruchowej i zachowań rozpoznawczych, podczas gdy uwodzenie, centrum i bezruchu to zachowania pozytywnie skorelowane ze strachem lub emocjonalnością ., Szczur został umieszczony w środku ciemnej plastikowej okrągłej areny (o średnicy 75 cm) w dźwiękoszczelnym pomieszczeniu o świetle 20 lux . Czas trwania każdej sesji behawioralnej wynosił 20 min. Oceniane parametry (ogólna aktywność ruchowa w odstępie 5 minut (przekroczenie granicy kwadratu z przednimi łapami i wychowaniem na ścianie), zachowania lękowe (pielęgnacja twarzy i ciała, mycie głowy, czas spędzony w centrum areny), unieruchomienie) zostały zarejestrowane i przeanalizowane w celu uzyskania punktów (Labehaviour).

2.5., Statystyka

analiza statystyczna składała się z jednokierunkowej lub dwukierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukey ' a z użyciem Graph pad® 6.0. wartość < 0,05 została uznana za statystycznie istotną.

3. Wyniki

dwukierunkowa analiza ANOVA wskazuje na różnice pomiędzy leczeniem a czasem dotyczące częstotliwości krzyżowania i odchowu ścian (Tabela 1). W szczególności podawanie BEO zmniejsza oba zachowania osiągające znaczenie statystyczne w porównaniu z grupą CTR (rycina 1)., Podawanie ogólnoustrojowe FLZ, 15 minut przed BEO, nie zmienia zmniejszenia częstości krzyżowania i odchowu ścianek mierzonego u szczurów leczonych olejkiem eterycznym (ryc. 1).

Analiza Anova jednokierunkowa wskazuje również różnice w czasie pielęgnacji, centrum i bezruchu (Tabela 2). U zwierząt leczonych Beo obserwuje się statystycznie znamienny spadek w porównaniu z grupą CTR. Wstępna obróbka FLZ nie jest w stanie zapobiec temu efektowi (Rysunek 2).,

w odniesieniu do okresu w środku areny wyniki wskazują, że systemowe podawanie BEO zmniejsza to zachowanie osiągające znaczenie statystyczne w porównaniu z grupą CTR (ryc. 2). Obróbka wstępna z FLZ nie wpływa na ten efekt BEO, chociaż wykazuje się nieznaczną tendencję () w kierunku zwiększenia czasu spędzanego w centrum (Rysunek 2).

ponadto zwierzęta leczone BEO, choć nadal czujne, spędzają więcej czasu w bezruchu w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 3)., Co ciekawe, u zwierząt wstępnie leczonych FLZ obserwuje się tendencję do zmniejszania bezruchu obserwowaną w grupie BEO, choć nie oblicza się różnicy statystycznej () (ryc. 3).

dla wszystkich badanych parametrów, wstępna obróbka FLZ w grupie kontrolnej nie wpływa na zachowania zwierząt w przypadku często podawanych literaturowych danych z zastosowaniem szerokiego zakresu dawek od 0, 1 do 10 mg/kg mc .

4., Dyskusja

BEO, podobnie jak inne olejki eteryczne, jest szeroko stosowany w aromaterapii w celu zminimalizowania objawów lęku wywołanego stresem, chociaż podstawowy mechanizm i jego zakłócenia w transmisji Gabaergicznej pozostają do wyjaśnienia .

podanie BEO wywiera działanie anksjolityczne u wielu pacjentów, które nie jest znacząco przeciwdziałane przez FLZ, antagonistę strony BDZ. Te ostatnie ustalenia potwierdzają, że właściwości BEO nie dorównują właściwościom BDZs ., W tym miejscu zaobserwowaliśmy, że aktywność ruchowa i zachowania rozpoznawcze, mierzone częstotliwościami krzyżowania i odchowu ścian, są zmniejszone u zwierząt leczonych BEO w porównaniu z grupą pojazdów, a wstępna obróbka FLZ nie zapobiegła wpływowi fitokompleksu. Co więcej, w 20-minutowej sesji często mierzy się zmniejszenie zachowania pielęgnacyjnego przez BEO, na które nie ma wpływu obróbka wstępna z FLZ. W sumie wyniki te wskazują, że receptor BDZ nie bierze udziału w tych działaniach BEO., Wstępna obróbka z FLZ częściowo zapobiega wpływowi BEO na unieruchomienie i czas spędzony w centrum areny, tj. zachowania pozytywnie skorelowane ze strachem lub emocjonalnością, choć nie osiągnęło to istotności statystycznej. Co ciekawe, te ostatnie wspierałyby zaangażowanie receptora GABA – A W wpływ BEO na te zachowania. Receptor GABA-A zawiera miejsce izosteryczne endogennego ligandu oraz kilka różnych miejsc wiązania allosterycznego, które pośrednio modulują aktywność receptora i są celami różnych związków syntetycznych i naturalnych ., Cząsteczki o różnych strukturach chemicznych i powinowactwach wpływają na miejsce wiązania i wykazują wyraźne działanie farmakologiczne. W szczególności kilka działań farmakologicznych można przypisać modulacji specyficznych podjednostek Alfa . Na przykład, właściwości uspokajające i hipnotyczne są pośredniczone przez receptory GABA-A zawierające podjednostki alfa-1, podczas gdy pozytywna modulacja receptorów GABA-A w podjednostkach alfa-2 i / lub alfa-3 wykazuje działanie anksjolityczne .,

Co ciekawe, wcześniej wykazaliśmy, że systemowe podawanie BEO powoduje umiarkowane uwalnianie GABA w hipokampie swobodnie poruszających się szczurów . To neurochemiczne odkrycie, wraz z opisywanym tu wpływem FLZ na unieruchomienie i centrum, może wspierać hipotezę, że niektóre związki obecne w fitokompleksie mogą zakłócać transmisję za pośrednictwem receptora GABA-A. W kilku badaniach zbadano udział tego neuroprzekaźnika w działaniu podobnym do anksjolitycznego pojedynczych lotnych związków obecnych w olejkach eterycznych, takich jak BEO., W szczególności autorzy sugerują, że droga podania związków może modulować ich działanie w miejscu, wpływając na działanie anksjolityczne. Na przykład linalool podawany drogą inhalacyjną wywołuje działanie przeciwlękowe zapobiegane przez FLZ, podczas gdy podawanie ogólnoustrojowe nie powoduje działania przeciwlękowego . Ponadto, podawanie ogólnoustrojowe mieszaniny epoksydu cis i trans (+)-limonenu wywołuje działanie anksjolityczne, któremu zapobiega się przez wstępną obróbkę FLZ . Jednakże, gdy (R)-(+)-limonen jest podawany drogą wziewną, działanie przeciwlękowe nie jest blokowane przez antagonistę receptora BDZ .,

inne systemy neuroprzekaźników są zaangażowane w działanie anksjolityczne wywołane przez olejki eteryczne. Na przykład myszy poddane inhalacji olejku cytrynowego wykazują działanie antystresowe poprzez modulację neurotransmisji dopaminergicznej, serotoninergicznej i Gabaergicznej . Inhalacja olejku lawendowego wykazuje działanie przeciwlękowe zwiększające poziom serotoniny (5-HT) w korze przedczołowej, prążkowiu i hipokampie ., Ponadto WAY100635, antagonista receptora 5-HT, blokuje działanie olejku eterycznego lawendy, podczas gdy stosowanie antagonistów receptora GABA – A jest pozbawione efektu . Podobne dane są również osiągnięte przez Galdino et al. i Tabari et al. którzy zaobserwowali działanie przeciwlękowe po ogólnoustrojowym wstrzyknięciu spiranthera odoratissima i olejków eterycznych z geranium różanego przeciwdziałane przez wstępną obróbkę antagonistami receptora 5-HT1A, ale nie przez FLZ .,

wszystkie te dane potwierdzają hipotezę, że działanie olejków eterycznych i prawdopodobnie BEO może być podkreślone przez wiele złożonych mechanizmów, które zasługują na dalsze badania.

5. Wnioski

BDZs są dobrze rozwiniętymi i powszechnie przepisywanymi lekami stosowanymi w leczeniu zaburzeń lękowych; jednak kilka działań niepożądanych (np. letarg, zawroty głowy, senność, sedacja i uzależnienie) może być ciężkich, więc konieczne jest opracowanie nowych leków., Te działania niepożądane spowodowały rozprzestrzenianie się aromaterapii, choć dostępne są ograniczone dane na temat mechanizmów leżących u podstaw aktywności anksjolitycznej olejków eterycznych. Wyniki naszych badań przyczyniają się do pogłębienia charakterystyki profilu neurofarmakologicznego BEO. Te ostatnie wspierają hipotezę, że działanie przeciwlękowe tego fitokompleksu nie nakłada się na działanie BDZs i jego aromaterapeutyczne zastosowanie w leczeniu lęku wywołanego stresem.,

dostępność danych

dane wykorzystane na poparcie wyników tego badania są dostępne od autora korespondenta na żądanie.

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktów interesów dotyczących publikacji niniejszego artykułu.

podziękowania

autorzy dziękują Guido Fico za umiejętne wsparcie techniczne. Prace te zostały poparte przez Uniwersytet Kalabrii ” ex quota 60%.”

---