wpływ dimetyloaminoetanolu i złożonego aminokwasu na indukowany D-galaktozą Model starzenia się skóry szczura
Streszczenie
trwałym marzeniem ludzi jest odwrócenie lub odroczenie starzenia się skóry. W tym badaniu dimetyloaminoetanol (DMAE) i złożony aminokwas (AA) w mezoterapii badano pod kątem ich potencjalnego działania przeciwstarzeniowego na starzenie się skóry wywołane D-galaktozą. W 18 dni po indukcji D-gal, każdy szczur był leczony śródskórną mikroiniekcją soli fizjologicznej, AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA lub 0,2% DMAE + AA, odpowiednio., Po 42 dniach od zabiegu pobrano i zbadano ranę skóry. Pomiar grubości naskórka i skóry w grupach DMAE + AA 0,1% i DMAE + AA 0,2% okazał się znacznie grubszy niż u starzejących się szczurów kontrolnych. Nie stwierdzono różnic w zawartości wody w tkankach pomiędzy grupami. Hydroksyprolina w 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA i pozorowanych grupach kontrolnych była znacznie wyższa niż wszystkie inne grupy. Ekspresja kolagenu typu i, typu III i MMP-1 była wysoko regulowana zarówno w grupach 0,1% DMAE + AA, jak i 0,2% DMAE + AA w porównaniu z kontrolą starzenia., Natomiast poziom ekspresji TIMP-1 w różnych grupach starzenia się był znacznie zmniejszony w porównaniu do kontroli pozorowanej. Koinjection DMAE i AA do tkanki docelowej ma znaczący wpływ antiaging na wywołany d-galaktozą model starzenia się skóry szczura.
1. Wstęp
Antiaging to odwieczny temat i marzenie człowieka., Zmiany skórne związane z wiekiem są nieuniknione i obejmują przerzedzenie, zwiotczenie, zmarszczki, utratę elastyczności, obszary suchości i odwrócony obrót kolagenu typu I/III w skórze, który przedstawiono jako zmniejszoną syntezę kolagenu typu I, ale zwiększoną produkcję kolagenu typu III . Obecnie Mezoterapia wzbudza zainteresowanie wszystkich jako strategia przeciwzmarszczkowa., Jest to małoinwazyjna procedura, która polega na śródskórnej mikroiniekcji substancji farmakologicznych, takich jak składniki odżywcze, hormony, witaminy, enzymy i inne odczynniki, które zostały rozcieńczone i są podawane bezpośrednio do leczonego regionu. W Warunkach sterylnej i profesjonalnej manipulacji Mezoterapia bardzo rzadko powoduje problemy z infekcją i martwicą skóry, z wyjątkiem pewnych drobnych zagrożeń, takich jak obrzęk i ból podczas wstrzyknięcia., Jako bezpieczny, prosty, mniej bolesny zabieg, który jest jednym z tak zwanych „lunchowych zabiegów kosmetycznych”, nie wymaga czasu na regenerację i jest idealny dla profesjonalistów i ludzi sukcesu w szybkim tempie współczesnego życia .
dimetyloaminoetanol (DMAE), analog choliny z grupy B i prekursor acetylocholiny, jest dziś coraz bardziej interesujący jako nowy suplement do pielęgnacji skóry ze względu na ostre działanie przeciwzmarszczkowe, przeciwzmarszczkowe i jędrność skóry. DMAE jest dobrze znany z zastosowania w zewnętrznych aplikacjach., W randomizowanych badaniach klinicznych wykazano, że żel do twarzy DMAE 3% jest bezpieczny i skuteczny w łagodzeniu linii czoła i drobnych zmarszczek okołooczodołowych, a także w poprawie pełności i kształtu warg oraz ogólnego wyglądu skóry twarzy . Otwarte rozszerzenie badania wykazało również, że długotrwałe stosowanie żelu DMAE przez okres do 1 roku wiązało się z dobrym profilem bezpieczeństwa ., Jednak leczenie tropikalne z DMAE zwykle wymaga wysokiej dawki i stężenia, aby przejść przez barierę przepuszczalności naskórka, co może powodować obawy dotyczące jego toksyczności, skutków ubocznych i kosztów medycznych. Stwierdzono, że 2,5-10 mmol/mL DMAE może powodować cytopatologię wakuolarną hodowanych in vitro ludzkich komórek fibroblastów. Ponadto badania wykazały, że stosowanie 3% żelu DMAE tropicznie może również powodować cytopatologię wakuolarną komórek naskórka ucha królika. Alternatywna dostawa DMAE jest potrzebna do oceny względnej skuteczności dla poprawy starzenia się skóry.,
w celu oceny potencjalnego działania przeciwstarzeniowego małych dawek DMAE podawanych śródskórnie przez miejscową mikroiniekcję (mezoterapię), w tym badaniu zmierzono strukturę tkanek i metabolizm kolagenowy starzejącej się skóry wywołanej przez D-gal. W międzyczasie badano również koinjekcję złożonego aminokwasu (AA), co prowadzi do zmniejszonej toksyczności komórkowej przez wstrzyknięcie DMAE i bycia lokalnym źródłem żywienia. Opisano również ich rozważany mechanizm działania w skórze.
2. Materiały i metody
2.1., Zwierzęta
Wszystkie zwierzęta ważyły 180-220 g w czasie operacji. Opieka nad zwierzętami i protokół eksperymentalny zostały zatwierdzone przez stowarzyszony Szpital Qingdao University Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.
ogółem 80 szczurów Wistar zostało losowo podzielonych na każdą grupę doświadczalną (zgodnie z Tabelą 1)., Zwierzętom z każdej leczonej grupy, z wyjątkiem pozorowanej grupy kontrolnej, podawano podskórne wstrzyknięcie D-galaktozy (D-gal) w dawce 125 mg/kg mc.·d przez 6 tygodni w celu wywołania modelu starzenia się skóry szczurów. W 18 dni po wstrzyknięciu D-gal, każdy szczur został znieczulony wodzianem chloralu (0,25 mL na 100 g masy ciała) i zdezynfekowany w obszarze biodra. Okrągły obszar tatuażu o długości 3 cm był prefabrykowany po każdej stronie biodra szczura, a następnie leczony w znieczuleniu ogólnym raz w tygodniu przez 4 tygodnie z śródskórną mikroiniekcją soli fizjologicznej (NS), AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA lub 0.,Odpowiednio 2% DMAE + AA. Zarówno starzenie negatywnej kontroli, jak i pozorowane grupy kontrolne otrzymały dokładnie ten sam zabieg chirurgiczny, ale bez żadnego leczenia objętego badaniem. W 42 dni po leczeniu wszystkie zwierzęta poddano eutanazji, a rany skórne porównywano za pomocą histologii, pomiaru zawartości wody, zawartości hydroksyproliny i ilościowego badania PCR w czasie rzeczywistym.
2.2. Badanie histopatologiczne
grubość skóry mierzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu SimplePCI (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) w sekcjach zabarwionych hematoksyliną i eozyną., Grubość naskórka mierzono od warstwy rogowej (SC) do dna brodawek skórnych, podczas gdy grubość skóry mierzono od górnej części brodawek do najgłębszych części siateczkowej skóry właściwej, aż do osiągnięcia tkanki tłuszczowej lub mięśni. W tym samym powiększeniu losowo wybrano 5 pojedynczych pozycji, aby zmierzyć grubość skóry z każdego z 5 pól widzenia na sekcję. Z Masson Trichrome stain wszystkich sekcji, 5 różne pola widzenia zostały również losowo wybrane i przeanalizowane pod kątem gęstości włókien kolagenowych.
2.3., Pomiar zawartości wody
zebrano 1 cm2 rany skóry i zmierzono dokładną masę mokrą, a następnie pieczono w temperaturze 80°C przez 12 godzin przed pomiarem suchej masy. Zawartość wody w skórze obliczono według wzoru procentowego zawartości wody = ((masa mokra − masa sucha) ÷ masa mokra) × 100%.
2.4. Pomiar zawartości hydroksyproliny
zawartość hydroksyproliny w ranie skórnej zmierzono zgodnie z protokołem wytwarzania komercyjnych zestawów testowych (NANJING JIANCHEN biological engineering Co., LTD, Nanjing, Chiny).
2.5., Ilościowa odwrotna transkrypcja-Reakcja łańcuchowa polimerazy (qRT-PCR)
rany skórne homogenizowano w TRIzol1 (Invitrogen), a całkowity RNA ekstrahowano zgodnie z protokołem producenta. 1 µg całkowitego RNA zostało odwrotnie transkrybowane do cDNA za pomocą systemu syntezy PrimeScript RT (Takara Biotechnology/Takara Bio, Dalian, Chiny). Z tymi produktami cDNA przeprowadzono bardzo czułą, ilościową metodę PCR. Wszystkie niestandardowe Podkłady i sondy zostały zweryfikowane pod kątem ich skuteczności (jak pokazano w tabeli 2)., Mieszanka reakcyjna 10 mL zawierała 2x Power SYBR1 Green PCR Master Mix, 10-krotnie rozcieńczony cDNA i 0,2 mM każdego podkładu. Protokół termiczny składał się z 10-minutowej aktywacji polimerazy w temperaturze 95°C, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95°C przez 30 s, wyżarzania podkładu w temperaturze 55°C przez 1 min i przedłużania w temperaturze 72°C przez 30 s. poziom ekspresji mRNA znormalizowano do poziomu endogennego genu referencyjnego β-action i przedstawiono jako zmiany fałdowe do tych uzyskanych z próbek skóry kontrolnej starzenia.,
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.6. Statistical Analysis
Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., Wyniki uznano za istotne statystycznie na poziomie prawdopodobieństwa .
3. Wyniki
3.1. Zmiany histologiczne
starzejąca się skóra wykazywała zmniejszoną grubość zarówno naskórka, jak i skóry właściwej w porównaniu z szczurami pozorowanymi. Wraz ze starzeniem się naskórek zmniejszył liczbę warstw komórkowych, a skórne włókna kolagenowe stały się rzadkie, smukłe lub złamane. W porównaniu do kontroli starzenia, jednak te zmiany histologiczne zostały znacznie złagodzone w 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA i 0,2% DMAE grupy (rysunki 1 (a) -1 (h)).
podczas leczenia 0,1% DMAE + AA lub 0.,2% DMAE + AA, zarówno naskórkowa, jak i skórna grubość i gęstość włókna kolagenowego były znacznie podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną starzenia. Ponadto samo 0,2% DMAE znacznie zwiększyło grubość i gęstość naskórka włókna kolagenowego w porównaniu do kontroli starzenia. Niemniej jednak te trzy parametry we wszystkich grupach starzenia się były znacznie zmniejszone w porównaniu do tych z pozorowanej grupy kontrolnej (rysunki 2(a), 2(b) i 2(c)).
3.2. Zawartość wody w starzejącej się skórze
nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w zawartości wody we wszystkich grupach (ryc. 2 (d)).,
3.3. Zawartość hydroksyproliny w starzejącej się skórze
zawartość hydroksyproliny była znacznie zwiększona w starzejącej się skórze, leczonej zarówno kompleksem 0,1% DMAE + AA, jak i 0,2% DMAE + AA, co wykazywało znaczące różnice w porównaniu do wszystkich innych grup starzenia. Co ciekawe, zawartość hydroksyproliny w 0,2% grupie DMAE + AA osiągnęła poziom równoważny z poziomem kontroli pozorowanej, ale była znacznie wyższa niż wszystkie pozostałe 6 grup starzenia. Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy 0,1% DMAE + AA i 0,2% DMAE + AA (rycina 2(e)).
3.4., ekspresja mRNA genów docelowych typu i, Typu III Procollagen, MMP-1 i TIMP-1
ekspresja kolagenu typu I była znacznie zwiększona w odpowiedzi zarówno na leczenie 0,1% DMAE + AA, jak i 0,2% DMAE + AA, co nie wykazało znaczącej różnicy w stosunku do kontroli pozorowanej. Jednak każda z innych grup starzenia wykazywała znacznie mniejszą ekspresję kolagenu typu I w porównaniu do pozorowanych szczurów kontrolnych(Rysunek 3 (a)). W przypadku leczenia 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA lub 0.,Tylko 2% DMAE, poziomy transkryptu dla kolagenu typu III były znacznie podwyższone w grupie kontrolnej starzenia się, ale znacznie mniej niż kontrola pozorowana(ryc. 3 (b)). Jako potencjalny kluczowy regulator starzenia się skóry, wiadomości MMP-1 wzrosły w odpowiedzi na leczenie 0,1% DMAE + AA lub 0,2% DMAE + AA, co wykazało statystycznie istotną różnicę w stosunku do kontroli starzenia się, ale nie fikcyjne szczury kontrolne (Rysunek 3(c)). W przeciwieństwie do tego, poziomy transkrypcji dla TIMP-1 we wszystkich grupach starzenia się były znacznie obniżone do znacznie niższego poziomu kontroli pozorowanej(Rysunek 3 (d)).,
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., Rany skóry poddano obróbce i analizie pod kątem ekspresji kolagenu typu I (a), kolagenu typu III (b), MMP-1 (c) i jego inhibitora oraz TIMP-1 (D) za pomocą ilościowego RT-PCR. Poziomy ekspresji dla każdego genu docelowego znormalizowano do endogennego genu referencyjnego i podawano jako wartości względne (ΔΔCt) do tych uzyskanych z grupy kontrolnej starzenia. i † wskazują znaczącą różnicę () w porównaniu do kontroli ujemnej (Grupa 1) i kontroli pozorowanej (grupa 8), odpowiednio.
4., Dyskusja
wstrzyknięcie małej dawki d-galaktozy do skóry szczura może wywołać zmiany przypominające przyspieszone starzenie. W naszych badaniach model starzenia się szczura wykazał zmiany koloru włosów, zmniejszoną aktywność i zaburzenia neurologiczne. Zmiany histologiczne D-gal wywołały starzenie się skóry, przedstawiane jako cieńszy naskórek ze zmniejszonymi warstwami komórkowymi i rzadkimi, smukłymi lub złamanymi włóknami kolagenowymi w warstwie skórnej. Ponadto starzenie się skóry wskazywało na niższy poziom zawartości hydroksyproliny i wiadomości mRNA dla kolagenu typu i, typu III, MMP – 1 i TIMP-1 w porównaniu do normalnej tkanki skóry., Wszystkie te dane sugerują, że wstrzyknięcie 125 mg/kg·D D-galaktozy przez 6 tygodni jest technicznie wykonalne, aby stworzyć podostry model starzenia się naśladujący ludzką skórę .
nasze badania wykazały, że koinjekcja DMAE i AA zwiększyła poziom zawartości hydroksyproliny i ekspresję kolagenu typu I d-gal wywołując starzenie się skóry, która osiągnęła w przybliżeniu ten sam poziom normalnej tkanki skóry po podaniu wysokiej dawki 0,2% DMAE + AA. Zmiany histologiczne pojawiły się w postaci podwyższonej grubości naskórka i skóry oraz ciasno ułożonych włókien kolagenowych skóry., Co ciekawe, Mezoterapia poprzez koinjekcję DMAE i AA znacznie zwiększyła ekspresję genu MMP-1 w starzejącej się skórze do równoważnego poziomu normalnych szczurów, ale nie dla inhibitora TIMP-1, który został znacznie obniżony u wszystkich starzejących się szczurów. Wyniki te sugerują, że mezoterapia poprzez koinjekcję DMAE i AA odegrała pozytywną regulację katabolizmu kolagenowego w naprawie i odbudowie starzejącej się skóry i opóźnieniu procesu starzenia się skóry., Poprzednie badania wykazały zmniejszoną produkcję kolagenu typu I i zwiększoną syntezę kolagenu typu III i MMP-1 w starzejącej się skórze ; jednak nasze wyniki wykazały, że ekspresja mRNA dla kolagenu typu III i MMP-1 była znacznie mniejsza w kontroli starzenia niż u normalnych szczurów. Może się zdarzyć, że metabolizm kolagenu przechodzi w inny sposób między normalnymi zmianami skórnymi z wiekiem a podostrym modelem starzenia się skóry wywołanym przez D-gal. Nasze badanie wykazało również, że wstrzyknięcie samego DMAE lub AA nie wykazało wpływu na zawartość hydroksyproliny lub wiadomości dla kolagenu typu I i MMP – 1 w starzejącej się skórze., Dane te wskazują, że jednoczesne stosowanie DMAE i AA może być jedynym sposobem na działanie przeciwstarzeniowe w tym modelu starzenia się skóry wywołanym przez D-gal, modulując metabolizm kolagenu typu I i odbudowując strukturę starzejącej się skóry.
poprzednie badania wykazały, że hodowane fibroblasty skórne królików reagowały na DMAE poprzez masową wakuolizację w sposób zależny od stężenia. Naskórek ucha zewnętrznego królika był również znacznie zagęszczony i wykazywał wyraźny obrzęk okoojądrowy wskazujący na wakuolizację w odpowiedzi na miejscowe zastosowanie 3% DMAE., Sugerowano, że cytopatologia wakuolarna nie może być oddzielona od poprawy wyglądu skóry, która jest szybko wytwarzana przez miejscowo podawane DMAE i może być komórkową podstawą działania przeciwzmarszczkowego DMAE . Z naszych wyników wynika, że wakuolizacja fibroblastów skórnych może wystąpić zarówno w 0,1%, jak i 0,2% DMAE leczonych starzejącą się skórą, powodując obrzęk komórkowy i zwiększoną gęstość włókien kolagenowych. Komórki nabłonkowe starzejącej się skóry mogły również reagować na wyższe stężenie 0,2% DMAE poprzez wakuolizację, co przedstawiało się jako zwiększona grubość naskórka., Mogą one jednak wymagać dalszych badań w celu wyjaśnienia tej kwestii.
ponadto pomiar zawartości wody w skórze nie wykazał różnic między wszystkimi leczonymi szczurami, co sugeruje, że DMAE i związek AA miały ograniczony wpływ na nawilżenie skóry. Może to być spowodowane niższym stężeniem i krótszym okresem działania miejscowego dostępnego DMAE w warstwie naskórka, gdy do podawania DMAE stosowano bezpośrednie wstrzyknięcie podskórne, co różni się od miejscowego stosowania DMAE.
5., Wnioski
dzięki indukowanemu przez D-galaktozę modelowi starzenia szczura Mezoterapia dostarczająca DMAE i AA bezpośrednio do tkanki docelowej ma wyraźne działanie przeciwstarzeniowe poprzez promowanie syntezy kolagenu i katabolizmu w celu przemodelowania tekstury skóry i poprawy grubości starzejącej się skóry. Chociaż w tych eksperymentach wykorzystano model szczura, wyniki są istotne dla prac klinicznych., Dalsze badania w celu zrozumienia mechanizmu działania dimetyloaminoetanolu i złożonego aminokwasu w starzejącej się skórze pomogą w opracowaniu i przetestowaniu silniejszych i skuteczniejszych schematów pielęgnacji skóry do dalszej oceny u ludzi.
konflikt interesów
autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w odniesieniu do publikacji niniejszego artykułu.