Zliczanie komórek za pomocą hemocytometru
Rysunek 1. Siatka hemocytometru.
diagram Hemocytometru wskazujący jeden z zestawów 16 kwadratów, które należy wykorzystać do liczenia.
transkrypcja webinaru
zliczanie komórek umożliwia dokładne określenie liczby komórek, a tym samym spójność między eksperymentami. Ten film przedstawia procedurę zliczania komórek zawiesiny i przylegania za pomocą hemocytometru.
przed rozpoczęciem pracy należy dokładnie spryskać wnętrze szafki zabezpieczającej przepływ laminarny środkiem dezynfekującym i wytrzeć do czysta chusteczką., Zużyte tkanki wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady. Następnie spryskaj wnętrze maski 70% etanolem i wytrzyj do czysta chusteczką. Okap jest teraz czysty i gotowy do użycia. Wyjąć pożywkę do hodowli komórek i trypsynę z lodówki i umieścić w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni C do ogrzania. Tymczasem spójrz na komórki, które mają być policzone za pomocą mikroskopu, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych wizualnych oznak zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego. Rozpyl butelki i pipety z 70% etanolem przed rozpoczęciem gry w szafce zabezpieczającej z przepływem laminarnym.,
w przypadku komórek zawiesinowych delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby komórki były dobrze wymieszane. Zanim będą mieli szansę się osiedlić, weź 0,5 mililitrową próbkę zawiesiny i pipet do sterylnej rurki eppendorfa. W przypadku komórek przylegających Usuń istniejące media, umyj w temperaturze pokojowej PBS i dodaj trypsin EDTA, aby odłączyć komórki. Należy zapoznać się z tabelą pierwszą dotyczącą wymaganych ilości PBS i trypsyny. Inkubować komórki przez dwie do pięciu minut w nawilżonym 37 stopni C, inkubator dwutlenku węgla. Czas inkubacji będzie musiał być zoptymalizowany dla typu komórki., Gdy wszystkie komórki są odłączone, zneutralizować trypsynę EDTA ciepłą surowicą zawierającą pożywki wzrostu właściwe dla komórek i hodowli. Wymagane objętości znajdują się w tabeli 1.
ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując zawiesinę komórek w górę iw dół trzy razy i przenieść je do 50 mililitrowej rurki. Odwirować zawiesinę komórki przez pięć minut z prędkością 1000 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej., Usunąć supernatant za pomocą sterylnego pipetu serologicznego i ponownie zawiesić paletę komórek surowicą 37-stopniową C zawierającą pożywki wzrostu do pierwotnej objętości wyjściowej hodowli. Używając 5 mililitrowej sterylnej pipety, pobrać i 0,5 mililitrową próbkę zawiesiny komórkowej i przenieść do sterylnej rurki eppendorfa.
aby liczyć, przygotuj jednorazowy hemocytometr. Używając pipety Gilsona P2000, weź 100 mikrolitrów zawiesiny i dodaj do 400 mikrolitrów trypanu blue, Uwaga .08% i dobrze wymieszać., Pobrać 100 mikrolitrów mieszanki zawiesiny niebieskich komórek trypanu i ostrożnie wrzucić kroplę zawiesiny do studni Komory liczenia, umożliwiając wciągnięcie próbki przez działanie kapilarne. Uważaj, aby nie przepełnić Komory liczenia. Zobacz obszar zliczania w 10-krotnym powiększeniu za pomocą odwróconego mikroskopu. Korzystając z mikroskopu, skup się na jednej z siatek cztery na cztery na hemocytometrze i policz komórki na ujemnym poziomie błękitu trypanowego. Te są realne. Zwróć również uwagę na to, ile komórek było pozytywnych dla błękitu trypanowego., Komórki te są martwe, a liczba ta może być wykorzystana później do obliczenia procentowej żywotności Kultury, jeśli jest to wymagane.
podczas liczenia stosuj system, w którym komórki są liczone tylko wtedy, gdy znajdują się w kwadracie, na prawej ręce lub dolnej linii granicznej. Należy zapisać liczbę komórek zliczonych w tym zestawie 16 kwadratów i przesunąć hemocytometr, aż wszystkie cztery zestawy 16 kwadratów na hemocytometrze zostaną policzone, a ich wartości zapisane., Aby obliczyć stężenie komórek, weź średnią liczbę żywych komórek w czterech zestawach 16 kwadratów i pomnóż przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek na mililitr. Następnie pomnóż to przez pięć, aby skorygować rozcieńczenie jednego do pięciu z dodatku trypanu niebieskiego. Ta końcowa wartość to liczba żywotnych komórek na mililitr w pierwotnej zawiesinie komórkowej.,
na przykład, jeśli twoja żywotna liczba komórek wynosi 200 000 komórek na mililitr w objętości 20 mililitrów i chcesz zobaczyć 10 000 komórek do nowej kolby, musisz przenieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórki do nowej kolby. Przenieść wymaganą objętość zawiesiny komórek do nowej kolby. Uzupełnij media i włóż do inkubatora.