Contagem de células utilizando um hemocitómetro
Figura 1. Gridlines de hemocitómetro.Diagrama de Hemocitómetro indicando um dos conjuntos de 16 quadrados que devem ser utilizados para a contagem.
Webinar transcript
Counting cells allows the accurate determination of cell numbers, and therefore, consistency between experiments. Este vídeo contará o procedimento para a contagem de células de suspensão e aderência usando um hemocitómetro.antes de iniciar o trabalho, pulverize cuidadosamente o interior do armário de segurança do fluxo laminar com desinfectante e limpe-o com tecido., Elimine o tecido usado no contentor de resíduos apropriado. Em seguida, pulverizar o interior do capô com 70% de etanol e limpar com tecido. O capô está agora limpo e pronto para usar. Remover o meio de cultura celular e tripsina do frigorífico, e colocar em uma incubadora humidificada de 37 graus C, dióxido de carbono para aquecer. Enquanto isso, olhe para as células a serem contadas usando um microscópio para verificar quaisquer sinais visuais de contaminação bacteriana e fúngica. Pulverizar garrafas e pipetas com etanol a 70% antes de jogar no armário de segurança do fluxo laminar.,para as células suspensas, agite suavemente o frasco para assegurar a boa mistura das células. Antes que eles tenham a chance de se instalar, pegue uma amostra de 0,5 mililitros de suspensão celular e pipet em um tubo eppendorf estéril. Para as células aderentes, remova os meios existentes, lave com PBS à temperatura ambiente e adicione tripsin EDTA para separar as células. Consultar o quadro 1 para os volumes de PBS e tripsina necessários. Incubar as células durante dois a cinco minutos na incubadora humidificada de 37 graus C, dióxido de carbono. O tempo de incubação terá que ser otimizado para o tipo de célula., Quando todas as células são destacadas, neutralize a tripsina EDTA com soro quente contendo meios de crescimento adequados às células e à cultura. Consulte o quadro 1 para os volumes necessários.o
re-suspende as células através de uma pipeta suave da suspensão celular para cima e para baixo três vezes e transfere-as para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão celular durante cinco minutos a 1000 rotações por minuto à temperatura ambiente., Remover o sobrenadante com uma pipeta serológica estéril e re-suspender a paleta da célula com um meio de crescimento de 37 graus C até ao volume original da cultura inicial. Utilizando uma pipeta esterilizada de cinco mililitros, Tome e 0,5 mililitros de suspensão celular e transfira para um tubo eppendorf estéril.para estar a contar, prepare o hemocitómetro descartável. Usando uma pipeta P2000 Gilson, tomar 100 microlitros de suspensão, e adicionar a 400 microlitros de azul de trypan, nota,.08% e misturar bem., Retirar 100 microlitros da mistura de suspensão com células azuis de trypan e pipetar cuidadosamente uma gota da suspensão para o poço da câmara de contagem, permitindo a acção capilar para retirar a amostra. Cuidado para não sobrecarregar a câmara de contagem. Ver a área de contagem sob uma ampliação de 10 vezes usando um microscópio invertido. Usando o microscópio, concentre-se numa das quatro por quatro grelhas no hemocitómetro e conte as células a um negativo para azul de trípano. Estes são viáveis. Além disso, note quantas células deram positivo para trypan blue., Estas células estão mortas, e este número pode ser usado mais tarde para calcular a viabilidade percentual da cultura, se necessário.
ao contar, utilize um sistema em que as células só são contadas quando estão dentro de um quadrado, ou na linha de fronteira direita ou inferior. Registar o número de células contadas neste conjunto de 16 quadrados e mover o hemocitómetro até que todos os quatro conjuntos de 16 quadrados do hemocitómetro tenham sido contados e os seus valores registados., Para calcular a concentração celular, Pegue o número médio de células viáveis nos quatro conjuntos de 16 quadrados e multiplique por 10 mil para obter o número de células por mililitro. Em seguida, multiplique isto por cinco para corrigir a diluição de um em cinco a partir da adição azul de trypan. Este valor final é o número de células viáveis por mililitro na suspensão celular original.,por exemplo, se a sua contagem de células viável for de 200 000 células por mililitro num volume de 20 mililitros e quiser ver 10 000 células no novo frasco, então terá de transferir 50 microlitros da sua suspensão celular para o novo frasco. Transferir o volume necessário de suspensão celular para o novo balão. Completar com a mídia e colocar na incubadora.