de métodos para a identificação de coagulase-negativo estafilococos

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA

a Comparação de métodos para a identificação de coagulase-negativo estafilococos

Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII

IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil

RESUMO

Coagulase-negativo estafilococos (CNS) identificação de espécies ainda é difícil para a maioria dos laboratórios clínicos., O esquema proposto por Kloos e Schleifer e modificado por Bannerman é o método de referência utilizado para a identificação de estafilococos espécies e subespécies; no entanto, este método é relativamente trabalhoso para uso de rotina, pois requer a utilização de um grande número de testes bioquímicos. O objetivo do presente estudo foi comparar quatro métodos, por exemplo, o método de referência, a API Staph sistema (bioMérieux) e dois métodos modificado a partir do método de referência em nosso laboratório (método simplificado e o método de disco), na identificação de 100 CNS cepas., Em comparação com o método de referência, o método simplificado e o método de disco identificaram corretamente 100 e 99% das espécies do SNC, respectivamente, enquanto esta taxa foi de 84% para o sistema API Staph. Foi observada uma identificação imprecisa pelo método API para Staphylococcus epidermidis (2, 2%), s. hominis (25%), s. haemolyticus (37, 5%) e S. warneri (47, 1%)., O método simplificado que utiliza o sistema de identificação simples proposto no presente estudo revelou-se eficiente para todas as estirpes testadas, com 100% de sensibilidade e especificidade, e provou ser uma alternativa disponível para a identificação de staphylococci, oferecendo maior fiabilidade e menor custo do que os sistemas comerciais actualmente disponíveis. Este método seria muito útil no laboratório de microbiologia clínica, especialmente em locais com recursos limitados., palavras-chave: estafilococos coagulase-negativos – métodos – identificação – API Staph

40 espécies do género Staphylococcus foram identificadas até à data (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, uma coagulase-positivo espécies que produz uma série de outras enzimas e toxinas, é o mais conhecido e tem sido frequentemente implicados na etiologia de uma série de infecções e intoxicações em animais e seres humanos, considerando que coagulase-negativo estafilococos (CNS), que representam a maioria das espécies, foram considerados saprófitas ou raramente patogênicos (Kloos & Schleifer 1975)., Ao longo da última década, no entanto, CNS foram reconhecidos como agentes etiológicos de uma série de processos infecciosos, representando os microorganismos mais comumente isolados de culturas de sangue (Huebner & Goldmann 1999).

Cerca de metade das espécies do SNC colonizam naturalmente os seres humanos, e actualmente são considerados essencialmente agentes etiológicos oportunistas, que prevalecem em numerosas situações orgânicas para produzir infecções graves (Bannerman 2003)., O surgimento do CNS como patógenos de diferentes infecções podem ser o resultado da crescente utilização de procedimentos invasivos tais como cateteres intravasculares e próteses em pacientes submetidos a tratamento intensivo, pacientes imunocomprometidos, crianças prematuras, doentes com neoplasias, e pacientes de transplante (Kloos & Bannerman 1994). as espécies que mais frequentemente causam doenças nos seres humanos São S., epidermidis (bacteremia, infecções devidas a dispositivos médicos implantados, tais como próteses e cateteres, infecção de feridas cirúrgicas, peritonite em doentes em diálise peritoneal contínua, osteomielite, endoftalmite, etc.), S. haemolyticus (endocardite, peritonite, septicemia e infecções do trato urinário, feridas, ossos e articulações), e S. saprophyticus (infecções urinárias e septicemic processos). Outros patógenos oportunistas significativos incluem S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus, E S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis parece estar associado com endocardite após a implantação de válvulas prostéticas, com peritonite, com infecção dos tecidos moles, e com osteomielite vertebral (Osmon et al. 2000). tendo em conta o potencial patogénico conhecido do SNC no ambiente hospitalar, o interesse pela variedade de espécies relacionadas com a infecção e o seu potencial toxigénico e virulência aumentou ao longo da última década e levou à publicação de vários estudos sobre estes aspectos., No entanto, apesar da crescente caracterização de infecções do SNC, estes microrganismos não são identificados em laboratórios de Microbiologia Clínica. O esquema proposto por Kloos e Schleifer (1975) e modificado por Bannerman (2003) é o método usado; no entanto, este método é relativamente trabalhoso para uso de rotina e que um grande número de testes bioquímicos são necessários., Na maioria dos laboratórios de rotina, os estafilococos são identificados com base em aspectos morfológicos das Colónias, coloração de gram e produção de catalase e coagulase, que apenas permitem a Classificação dos estafilococos em isolados de S. aureus e não-S. aureus, sendo estes últimos simplesmente classificados como SNC. o desenvolvimento de métodos para a identificação de espécies e subespécies estafilocócicas permite aos clínicos obter informações sobre a variedade de SNC presentes em espécimes clínicos e considerá-los como agentes etiológicos de processos infecciosos., É necessária uma identificação precisa do SNC, a fim de se ter uma previsão precoce da potencial patogenicidade ou susceptibilidade aos antibióticos de cada isolado clínico e para clarificar o significado clínico de cada espécie. Devem ser identificados isolados do SNC repetidos de doentes com doenças invasivas para permitir a comparação das estirpes. Por outro lado, a identificação das espécies é um pré-requisito antes da realização de procedimentos de tipagem para estudos epidemiológicos.,

nos últimos anos, vários sistemas comerciais para a rápida identificação de estafilococos foram desenvolvidos como uma alternativa aos protocolos de identificação clássicos (Bannerman 2003). No entanto, estes sistemas de diagnóstico apresentam problemas como o custo e o tempo de incubação, muitas vezes fornecem resultados pouco fiáveis (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Além disso, muitos destes kits foram projetados para a identificação de todas as espécies conhecidas do SNC (ou seja, isolados clínicos, veterinários e alimentares) e, portanto, não são muito específicos., Com base nas considerações acima, e tendo em vista a necessidade de rápida, simples e confiável métodos, o objetivo do presente estudo foi comparar quatro técnicas para a identificação do CNS, por exemplo, um método de referência (Kloos & Schleifer 1975, porta estandarte, 2003), o comercial API Staph sistema, e dois métodos modificado a partir do método de referência em nosso laboratório para desenvolver alternativas de métodos de identificação de combinação de simplicidade, confiabilidade e baixo custo, especialmente para locais com recursos limitados.,foram estudados materiais e métodos isolados de cem isolados do SNC obtidos a partir de amostras clínicas de doentes hospitalizados no Hospital Universitário da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de Botucatu. As estirpes foram isoladas como descrito por Koneman et al. (1997). identificação do SNC-os isolados obtidos a partir de amostras clínicas foram revestidos de ágar de sangue e de gram manchados, a fim de garantir a sua pureza e a preservação da sua morfologia e coloração específica., Após confirmação destas características, os isolados foram submetidos aos testes da catalase e da coagulase. Staphylococcus foi diferenciada de espécies de Micrococcus na base de oxidação e fermentação da glicose, resistência à bacitracina (0,04 e U) indicado pela ausência de um halo de inibição ou a presença de um halo de inibição de medição de até 9 mm de diâmetro, e a suscetibilidade a furazolidona (100 µg), caracterizada por zonas de inibição de medição de 15 a 35 mm de diâmetro (Baker, 1984). os quatro métodos descritos abaixo foram utilizados para a identificação do SNC., A seguinte referência internacional CNS cepas foram utilizados como controles: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), e S. saprophyticus (ATCC 15305).,

método de Referência proposto por Kloos e Schleifer (1975) e Bannerman (2003) – Este método consiste em um conjunto de testes bioquímicos que determinar a utilização dos açúcares xilose, arabinose, sacarose, trealose, maltose, manitol, lactose, xilitol, ribose, frutose e manose, a produção de hemolysin, nitrato de redução, a presença de urease e ornitina descarboxilase, e a resistência à novobiocin caracterizada por um halo de inibição de até 16 mm. As leituras dos testes foram obtidos após 24, 48 e 72 h de incubação a 37ºC em um ar incubadora., API Staph-o sistema API Staph (bioMérieux) é uma bateria de teste pronta a usar, composta por 20 testes bioquímicos aos quais se adiciona uma suspensão bacteriana homogénea a 0,5 McFarland turvação. Após 24 h de incubação a 37ºC e, além do vice-presidente (VP1 e VP2), NIT (NIT1 e NIT2) e PAL (ZYM UM e ZYM B) reagentes que acompanha o kit, as reações foram interpretados e microorganismos foram identificados usando o catálogo analítico., A identificação é baseada em um sistema numérico que consiste de sete dígitos que fornece identificação por cento (%ID), com um valor > 80% sendo aceitável. métodos modificados-foram utilizados dois métodos de identificação modificados em nosso laboratório (método simplificado e método de disco). O método simplificado foi dividido em duas etapas. Durante o primeiro passo, foram testados a fermentação da xilose, sacarose, trealose, maltose e manitol, a produção de hemolisina e o crescimento anaeróbico do tioglicolato (Quadro I)., Os testes utilizados na segunda etapa variaram de acordo com os resultados obtidos na primeira etapa de identificação após incubação de 72-h a 37ºC. Os exames complementares utilizados durante a segunda etapa (quando necessário) são especificados na Tabela II.

O disco método consistiu dos seguintes testes: a fermentação da arabinose, sacarose, trealose, maltose, manitol e lactose, nitrato de redução, a produção de hemolysin, testes de urease e ornitina descarboxilase, e a resistência à novobiocin., Para o ensaio de fermentação do açúcar, foram colocados discos comercialmente disponíveis específicos para cada açúcar em tubos contendo 2,5 ml de caldo púrpura de base. Suspensões bacterianas foram inoculadas como descrito por Kloos e Schleifer (1975). As leituras dos dois métodos foram obtidas após 24, 48 e 72 h de incubação a 37ºC, e as espécies do SNC foram identificadas de acordo com o esquema de identificação proposto na figura.,

análise Estatística Para determinar o grau de concordância entre os métodos utilizados para a identificação do CNS (método simplificado, o método de disco e API Staph) e o método de referência (Kloos & Schleifer 1975, porta estandarte, 2003), a sensibilidade e a especificidade dos testes Sox (1986) foram avaliados da seguinte maneira.,

Sensibilidade: proporção de CNS cepas que testou positivo para uma determinada espécie pelo método de referência e que foram identificadas como a mesma espécie pelo método analisados (método simplificado, disco ou API Staph).

Especificidade: proporção de CNS cepas que deu negativo para uma determinada espécie pelo método de referência e que também foram negativos para a mesma espécie, quando testadas pelo método analisados (método simplificado, disco ou API Staph).os 100 isolados estafilocócicos foram testados pelos quatro métodos propostos., Os resultados obtidos com o método de referência (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) foram comparados com os obtidos com os métodos modificados e com o sistema API Staph. a tabela III Mostra o Acordo na identificação entre os ensaios analisados e o método de referência. O método simplificado e o método do disco mostraram positividade de 100 e 99% quando comparados ao método de referência, enquanto esta porcentagem foi de 84% para o sistema de agrafos API. Dos 16 isolados com desacordo de identificação pelo método API Staph, 10 (62.,5%) mostrou a identificação correta, mas com uma ID %de 7,1 a 31%, inferior ao valor aceitável.

O método simplificado realizado em duas fases não diferiu do método de referência em termos de identificação de espécies do SNC. Em contraste com os outros métodos, o método do disco mostrou identificação imprecisa e erroneamente identificado uma estirpe S. hominis (6,5%) devido à não fermentação da sacarose no disco, levando à classificação desta estirpe como S. caprae. Não foi observada incongruência para as outras espécies.,

A maior discrepância foi observada entre o método de referência e a API Staph sistema, com este último método não identificar com precisão de 1 de S. epidermidis tensão (identificado como S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus cepas (2 identificadas como S. aureus e 1 como S. hominis), 4 cepas de S. hominis (2 identificadas como S. lugdunensis, 1 como S. haemolyticus e 1 como S. aureus), e 8 S. warneri de tensão (3 identificadas como S. lugdunensis, 2 como S. haemolyticus, 2 como S. hominis e 1 como S. saprophyticus) (Tabela III).,

debate

SNC são os microrganismos mais frequentemente isolados de culturas sanguíneas, representando um grave problema de saúde em muitos países em desenvolvimento e também desenvolvidos (Renneberg et al. 1995). Alguns estudos sugeriram uma associação entre S. epidermidis e infecções nosocomiais (Vuong & Otto 2002) com esta espécie sendo identificada em 74 a 92% dos doentes com bacteremias causadas pelo SNC (Martin et al. 1989). Contudo, outros estudos relataram uma série de infecções causadas por outras espécies do SNC (Herwaldt et al. 1996), principalmente S., hemolyticus, que é a segunda espécie mais frequentemente detectada (Bannerman 2003). Desde CNS são os agentes etiológicos de uma série de processos infecciosos, a identificação desses microrganismos são importantes para a determinação das suas características fisiopatológicas e importância clínica e em estudos epidemiológicos, e levou para a publicação de diversos estudos de análise de métodos de identificação para que essas bactérias (Knapp & Washington De 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini et al. 1994, Renneberg et al. 1995, Ieven 1995, de Paulis et al. 2003).,

no presente estudo, os métodos modificados em nosso laboratório produziram bons resultados em termos de classificação correta das espécies do SNC em comparação com o método de referência, com 100% de concordância com o método modificado simplificado e 99% de concordância com o método do disco.

O método simplificado usando o esquema de identificação aqui proposto (Figura) levou à identificação de S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis, S. simulans em uma única etapa, usando um total de sete testes bioquímicos, um número menor do que a empregada no método de referência (16 testes)., Uma vez que a S. epidermidis é a espécie mais frequentemente isolada, 70 a 90% das estirpes (Bannerman 2003) isoladas no laboratório clínico podem ser identificadas utilizando um número reduzido de testes.

no que diz respeito ao tempo de incubação, os resultados mostraram que 91% das estirpes analisadas no estudo fermentaram o açúcar específico da espécie em 48 h após a incubação a 37ºC., As outras estirpes (9%) apresentaram resultados positivos na fermentação de determinados açúcares após 72 h de incubação, demonstrando a importância de uma incubação dos testes de fermentação do açúcar de, pelo menos, 72 h, a fim de identificar correctamente estes microrganismos.

A identificação de S. cohnii, S. schleiferi subespécies schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus e S. lugdunensis necessária a execução de dois ou três testes bioquímicos adicionais, conhecido como a segunda etapa, que variavam de acordo com o resultado obtido na primeira etapa do método simplificado., Contudo, 20 (37,7%) estirpes que exigiram o segundo passo para a identificação da trealose fermentada no prazo de 24 h, permitindo assim a continuação prévia dos testes adicionais. Mais tempo foi necessário para identificar S. cohnii, S. schleiferi subespécies schleiferi, e S. caprae, desde o segundo passo necessário para a identificação destas espécies incluídas a redução de nitrato de teste, cujo resultado está disponível apenas depois de 48 h. No entanto, este fato não resultar num atraso no diagnóstico de SNC, já que a frequência destas espécies em amostras clínicas é baixo.,

o método do disco também foi considerado altamente eficiente e prático, uma vez que não requer preparação prévia de açúcares, evitando assim a perda de meios de cultura, além de alcançar um acordo elevado na identificação do SNC com o método de referência.

O kit de estafilococo comercial mostrou a menor precisão na identificação do SNC entre os métodos estudados( acordo de 84%), de acordo com os estudos de (Bannerman et al. 1993, Renneberg et al. 1995). warneri e S. hominis foram as espécies mais difíceis de identificar. Bannerman et al., (1993) also reported a lower accuracy in the identification of these species. In the study of Ieven et al. (1995), S. hominis was identified with the least accuracy by the API ID 32 Staph system. Este resultado pode ser explicado pela falta de testes complementares, tais como resistência à novobiocina, crescimento anaeróbico na produção de tioglicolatos e hemolisinas. no caso de S., hemolítico, a identificação incorrecta pelo sistema API Staph pode ser explicada pelo facto de o kit não sugerir a produção de hemolisina como um teste complementar, o que seria essencial para a identificação das estirpes de S. hemolítico. Três (3%) das 100 estirpes analisadas pelo sistema API Staph foram identificadas como S. aureus, fato também relatado por Renneberg et al. (1995). O kit foi considerado ineficiente nestes casos, uma vez que não solicitava o resultado do teste fundamental e mais amplamente aceito para a identificação de S. aureus, ou seja, a identificação de S. aureus.,, o teste da coagulase (Koneman et al. 1997). de acordo com Piccolomini et al. (1994), o baixo acordo entre a API Staph e o teste bioquímico tradicional para identificação do SNC pode ser explicado pela utilização de diferentes tempos de incubação, concentrações de substrato e/ou marcadores de sensibilidade.,

Em conclusão, os dois métodos modificados em nosso laboratório, foram encontrados para ser altamente eficiente para uso de rotina devido à sua alta sensibilidade e especificidade em comparação ao método de referência, além de exigir menos testes e, portanto, sendo mais econômico e mais rápido do que o método padrão. Apesar de requerer um tempo de incubação mais curto (18 h), o sistema API Staph mostrou uma menor sensibilidade na identificação de algumas espécies., Sem dúvida, a identificação das espécies do SNC será facilitada e incentivada pela disponibilidade de um procedimento simples, barato e preciso, especialmente em locais com recursos limitados.agradecimentos a bioMérieux pela doação dos kits de estafilococos da API utilizados no presente estudo.

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