Microscópio Resolução: Conceitos, Fatores e Cálculo
a Tomar todas as teorias acima em consideração, é claro que há um número de fatores a serem considerados quando do cálculo teórico limites da resolução. A resolução depende também da natureza da amostra. Vamos olhar para o cálculo da resolução usando o limite de difração da Abbe e também usando o critério de Rayleigh.,
Em primeiro lugar, deve-se lembrar que:
NA= n x sin α
Onde N é o índice de refração do meio imagiológico e α é metade da abertura angular do objetivo. A abertura angular máxima de um objetivo é de cerca de 144º. O seno de metade deste ângulo é 0,95. Se usar um objetivo de imersão com óleo que tem um índice de refração de 1,52, o NA máximo do objetivo será 1,45. Se usar um objetivo “seco” (não-imersão) o NA máximo do objetivo será 0,95 (como o ar tem um índice de refração de 1,0).a fórmula de difração de Abbe para lateral (i.e., XY) resolução é:
D= λ/2 na
Em Que λ é o comprimento de onda da luz utilizado para a imagem de uma amostra. Se utilizar uma luz verde de 514 nm e um objectivo de imersão em óleo com uma NA de 1,45, o limite (teórico) de resolução será de 177 nm.a fórmula de difração de Abbe para resolução axial (ou seja, Z) é:
D= 2 λ/na2
novamente, se assumirmos um comprimento de onda de 514 nm para observar uma amostra com um valor NA de 1.45, então a resolução axial será de 488 nm.
O critério de Rayleigh é uma fórmula ligeiramente refinada baseada nos limites de difração de Abbe:
r= 1.,22 λ/naobj+NAcond
Em Que λ é o comprimento de onda da luz utilizado para a imagem de uma amostra. NAobj é o NA do objetivo. NAcond é o NA do condensador. A figura de “1.22” é uma constante. Isto é derivado do trabalho de Rayleigh nas funções de Bessel. Estes são usados para calcular problemas em sistemas como a propagação de ondas.
levando em consideração a NA do condensador, o ar (com um índice de refração de 1.0) é geralmente o meio imagiológico entre o condensador e o slide. Assumindo que o condensador tem uma abertura angular de 144º, então o valor de NAcond será igual a 0,95.,se usando uma luz verde de 514 nm, um objetivo de imersão em óleo com uma NA de 1,45, condensador com uma NA de 0,95, então o limite (teórico) de resolução será de 261 nm.
conforme indicado acima, quanto mais curto o comprimento de onda da luz usado para a imagem de uma amostra, então mais detalhes serão resolvidos. Assim, se usando o comprimento de onda visível mais curto de luz de 400 nm, com um objetivo de imersão em óleo com uma NA de 1,45 e um condensador com uma NA de 0,95, então R seria igual a 203 nm.,
para atingir a resolução máxima (teórica) num sistema de microscópio, cada um dos componentes ópticos deve ser da mais elevada NA Disponível (tendo em conta a abertura angular). Além disso, usando um comprimento de onda mais curto de luz para ver o espécime irá aumentar a resolução. Finalmente, todo o sistema de microscópio deve ser alinhado corretamente.