dintre metodele de identificare a stafilococi coagulazo-negativi
BIOCHIMIE CARACTERIZAREA
Comparație între metodele de identificare a stafilococi coagulazo-negativi
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP, Brazilia
REZUMAT:
stafilococi Coagulazo-negativi (CNS) identificarea speciilor este încă dificil pentru cele mai multe laboratoare clinice., Schema propusă de Kloos și Schleifer și modificată prin Bannerman este metoda de referință utilizată pentru identificarea stafilococice specii și subspecii; cu toate acestea, această metodă este relativ laborioasă pentru utilizarea de rutină deoarece necesită utilizarea unui număr mare de teste biochimice. Obiectivul prezentului studiu a fost de a compara patru metode, și anume, metoda de referință, API Staph sistem (bioMérieux) și două metode modificat de metoda de referință în laboratorul nostru (metoda simplificată și metoda de disc), în identificarea de 100 CNS tulpini., Comparativ cu metoda de referință, metoda simplificată și metoda discului au identificat corect 100 și, respectiv, 99% din speciile SNC, în timp ce această rată a fost de 84% pentru sistemul API Staph. Identificarea inexactă prin metoda stafilococilor API a fost observată pentru Staphylococcus epidermidis (2,2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37,5%) și S. warneri (47,1%)., Metoda simplificată, utilizând schema simplă de identificare propusă în studiul de față, s-a dovedit a fi eficientă pentru toate tulpinile testate, cu sensibilitate și specificitate 100% și s-a dovedit a fi o alternativă disponibilă pentru identificarea stafilococilor, oferind, fiabilitate mai mare și costuri mai mici decât sistemele comerciale disponibile în prezent. Această metodă ar fi foarte utilă în laboratorul de microbiologie clinică, în special în locuri cu resurse limitate.,
cuvinte Cheie: stafilococi coagulazo-negativi – metode de identificare API Staph
Patruzeci de specii din genul Staphylococcus au fost identificate până acum (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser și colab. 2003). S., aureus, un coagulazo-pozitiv specie care produce o serie de alte enzime și toxine, este cel mai cunoscut și a fost frecvent implicat în etiologia de o serie de infecții și intoxicații la animale și la om, întrucât stafilococi coagulazo-negativi (CNS), care reprezintă majoritatea speciilor, au fost considerate a fi saprofite sau rareori patogene (Kloos & Schleifer 1975)., În ultimul deceniu, însă, CNS au fost recunoscuți ca agenți etiologici ai unei serii de procese infecțioase, reprezentând microorganismele cel mai frecvent izolate din culturile de sânge (Huebner & Goldmann 1999). aproximativ jumătate din speciile SNC colonizează în mod natural oamenii, iar în prezent sunt considerați agenți etiologici în esență oportuniști, care predomină în numeroase situații organice pentru a produce infecții severe (Bannerman 2003)., Apariția unor CNS ca agenți patogeni de diferite infecții poate fi rezultatul de utilizarea tot mai mare de proceduri invazive, cum ar fi catetere intravasculare și proteze la pacienții în curs de tratament intensiv, pacienții imunocompromiși, copii prematuri, pacienții cu neoplazii, și la pacienții cu transplant (Kloos & Bannerman 1994). speciile care cauzează cel mai frecvent boli la om sunt S., epidermidis (bacteriemie, infecții datorate dispozitivelor medicale implantate, cum ar fi proteze și catetere, infecții ale rănilor chirurgicale, peritonită la pacienții cu dializă peritoneală continuă, osteomielită, endoftalmită etc.), S. haemolyticus (endocardite, peritonite, septicemii și infecții ale tractului urinar, răni, oase și articulații), și S. saprophyticus (infecții urinare și septicemic procese). Alte semnificative de agenți patogeni oportuniști includ S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus, și S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis pare a fi asociate cu endocardita după implantarea de proteze, valve, cu peritonită, cu infectie a tesuturilor moi, și cu osteomielita vertebrală (Osmon et al. 2000). având în vedere potențialul patogen cunoscut al SNC în mediul spitalicesc, interesul privind varietatea speciilor legate de infecție și potențialul toxigenic și virulența acestora a crescut în ultimul deceniu și a condus la publicarea diverselor studii asupra acestor aspecte., Cu toate acestea, în ciuda caracterizării în creștere a infecțiilor SNC, aceste microorganisme nu sunt identificate în laboratoarele de Microbiologie Clinică. Schema propusă de Kloos și Schleifer (1975) și modificată de Bannerman (2003) este metoda utilizată convențional; cu toate acestea, această metodă este relativ laborioasă pentru utilizarea de rutină, deoarece este necesar un număr mare de teste biochimice., În majoritatea laboratoarelor de rutină, stafilococii sunt identificați pe baza aspectelor morfologice ale coloniilor, colorației gram și producției de catalază și coagulază, care permit doar clasificarea stafilococilor în izolatele S. aureus și non-S. aureus, acestea din urmă fiind pur și simplu clasificate ca CNS. dezvoltarea metodelor de identificare a speciilor și subspeciilor stafilococice permite clinicienilor să obțină informații despre varietatea SNC prezentă în probele clinice și să le considere agenți etiologici ai proceselor infecțioase., Identificarea exactă a SNC este necesară pentru a avea o predicție timpurie a patogenității potențiale sau a susceptibilității la antibiotice a fiecărui izolat clinic și pentru a clarifica semnificația clinică a fiecărei specii. Trebuie identificate izolate repetate la nivelul SNC de la pacienții cu boli invazive, pentru a permite o comparație a tulpinilor. Pe de altă parte, identificarea speciilor este o condiție prealabilă înainte de efectuarea procedurilor de tastare pentru studiile epidemiologice., în ultimii ani, mai multe sisteme comerciale pentru identificarea rapidă a stafilococilor au fost dezvoltate ca o alternativă la protocoalele clasice de identificare (Bannerman 2003). Cu toate acestea, aceste sisteme de diagnosticare prezintă probleme cum ar fi costul și timpul de incubație, adesea oferă rezultate nesigure (Grant et al. 1994, Perl și colab. 1994). În plus, multe dintre aceste kituri au fost concepute pentru identificarea tuturor speciilor cunoscute de SNC (adică izolate clinice, veterinare și alimentare) și, prin urmare, nu sunt foarte specifice., Pe baza considerațiilor de mai sus și având în vedere necesitatea rapid, simplu, și metode fiabile, obiectivul prezentului studiu a fost de a compara patru tehnici de identificare a SNC, de exemplu, o metodă de referință (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), comerciale API Staph sistem, și două metode modificat de metoda de referință în laboratorul nostru pentru a dezvolta alternative metode de identificare combinând simplitatea, fiabilitatea, și low-cost, mai ales în locuri cu resurse limitate.,materiale și metode au fost studiate izolatele – o sută de izolate ale SNC obținute din probele clinice ale pacienților internați la Spitalul Universitar al Facultății de Medicină, Universidade Estadual Paulista (Unesp), campusul Botucatu. Tulpinile au fost izolate așa cum este descris de Koneman și colab. (1997). identificarea SNC-izolatele obținute din probele clinice au fost placate pe Agar de sânge și gram colorate pentru a garanta puritatea lor și păstrarea morfologiei lor și a colorației specifice., După confirmarea acestor caracteristici, izolatele au fost supuse testelor de catalază și coagulază. Staphylococcus fost diferențiat de Micrococcus specii pe baza de oxidare și fermentare a glucozei, rezistenta la bacitracină (0.04 U) indicată de absența unui inhibarea halo sau prezența unui inhibarea halo de măsurare de până la 9 mm în diametru, și susceptibilitatea la furazolidon (100 µg) caracterizate prin zone de inhibare măsurare 15 la 35 mm în diametru (Baker 1984). cele patru metode descrise mai jos au fost utilizate pentru identificarea SNC., Următoarele internaționale de referință CNS tulpini au fost folosite ca martori: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), și S. saprophyticus (ATCC 15305).,
metoda de Referință propus de Kloos și Schleifer (1975) și Bannerman (2003) – Această metodă constă dintr-un set de teste biochimice care determină utilizarea de zaharuri xiloză, arabinoză, zaharoză, trehaloză, maltoză, manitol, lactoză, xilitol, riboza, fructoză, manoză, producția de gemolizinovoj, de reducere a nitraților, prezența ureazei și ornitin decarboxilaza, și rezistență la novobiocin caracterizează printr-o inhibiție halo de până la 16 mm. Lecturi de teste au fost obținute după 24, 48 și 72 de ore de incubare la 37ºC într-un incubator., API Staph-sistemul API Staph (bioMérieux) este o baterie de testare gata de utilizare constând din 20 de teste biochimice la care se adaugă o suspensie bacteriană omogenă la turbiditate de 0,5 McFarland. După 24 h de incubare la 37 ° c si plus de VP (VP1 și VP2), NIT (NIT1 și NIT2) și PAL (ZYM O și ZYM B) reactivi care însoțește kit, reacțiile au fost interpretate și microorganisme au fost identificate cu ajutorul analitice catalog., Identificarea se bazează pe un sistem numeric format din șapte cifre, care oferă procente de identificare (%ID), cu o valoare > 80% fiind acceptabil. metode modificate – au fost utilizate două metode de identificare modificate în laboratorul nostru (metoda simplificată și metoda discului). Metoda simplificată a fost împărțită în două etape. În timpul primei etape, au fost testate fermentarea xilozei, zaharozei, trehalozei, maltozei și manitolului, producția de hemolizină și creșterea anaerobă în tioglicolat (tabelul I)., Testele utilizate în a doua etapă au variat în funcție de rezultatele obținute în prima etapă de identificare după incubarea 72-h la 37ºC. Complementare teste utilizate în timpul al doilea pas (când este necesar) sunt specificate în Tabelul II.
disc metoda a constat din următoarele teste: fermentarea arabinozei, zaharoză, trehaloză, maltoză, manitol și lactoză, de reducere a nitraților, producția de gemolizinovoj, teste pentru ureazei și ornitin decarboxilaza, și rezistență la novobiocin., Pentru testul de fermentare a zahărului, discurile disponibile în comerț specifice fiecărui zahăr au fost plasate în tuburi care conțin 2,5 ml mediu de bază de bulion Violet. Suspensiile bacteriene au fost inoculate așa cum au fost descrise de Kloos și Schleifer (1975). Citirile pentru cele două metode au fost obținute după 24, 48 și 72 h de incubare la 37ºC, iar speciile SNC au fost identificate conform schemei de identificare propuse în figură.,
analiză Statistică – Pentru a determina gradul de acord între metodele utilizate pentru identificarea CNS (metoda simplificată, metoda de disc și API Staph) și metoda de referință (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003), sensibilitatea și specificitatea testelor (Sox 1986) au fost evaluate după cum urmează., sensibilitate: proporția tulpinilor SNC care au fost pozitive pentru o anumită specie prin metoda de referință și care au fost identificate ca fiind aceeași specie prin metoda analizată (metodă simplificată, disc sau API Staph). specificitate: proporția tulpinilor SNC care au fost negative pentru o anumită specie prin metoda de referință și care au fost, de asemenea, negative pentru aceeași specie atunci când au fost testate prin metoda analizată (metoda simplificată, disc sau API Staph).cele 100 de izolate stafilococice au fost testate prin cele patru metode propuse., Rezultatele obținute cu metoda de referință (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) au fost comparate cu cele obținute cu metode modificate și API Staph sistem. tabelul III prezintă acordul de identificare între testele analizate și metoda de referință. Metoda simplificată și metoda discului au arătat o pozitivitate de 100 și 99% în comparație cu metoda de referință, în timp ce acest procent a fost de 84% pentru sistemul API Staph. Dintre cele 16 izolate cu dezacord de identificare prin metoda API Staph, 10( 62.,5%) a arătat identificarea corectă, dar cu un ID% de 7,1 până la 31%, mai mic decât valoarea acceptabilă. metoda simplificată efectuată în două etape nu diferă de metoda de referință în ceea ce privește identificarea speciilor SNC. În contrast cu alte metode, metoda de disc arătat inexacte identificarea și identificată în mod eronat un S. hominis tulpina (6.5%), ca urmare a non-fermentarea zaharozei pe disc, ceea ce duce la clasificarea această tulpină de S. caprae. Nu s-au observat incongruențe la celelalte specii.,
Cea mai mare discrepanță a fost observată între metoda de referință și API Staph sistem, cu aceasta metoda nu identificarea cu exactitate 1 S. epidermidis tulpina (identificat ca fiind S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus tulpini (2 identificat ca fiind S. aureus și 1 S. hominis), 4 S. hominis tulpini (2 identificat ca fiind S. lugdunensis, 1 și S. haemolyticus și 1 S. aureus), și 8 S. warneri tulpina (3 identificat ca fiind S. lugdunensis, 2 și S. haemolyticus, 2 ca S. hominis și 1 S. saprophyticus) (Tabelul III)., CNS sunt microorganismele cel mai frecvent izolate din culturile de sânge, reprezentând o problemă gravă de sănătate în multe țări în curs de dezvoltare și, de asemenea, dezvoltate (Renneberg et al. 1995). Unele studii au sugerat o asociere între S. epidermidis și infecții nosocomiale (Vuong & Otto 2002) cu această specie a fost identificată în 74 la 92% dintre pacienții cu bacteremias cauzate de SNC (Martin et al. 1989). Cu toate acestea, alte studii au raportat o serie de infecții cauzate de alte specii ale SNC (Herwaldt et al. 1996), în principal S., haemolyticus, care este a doua specie cel mai frecvent detectată (Bannerman 2003). Din SNC sunt agenți etiologici de o serie de procese infecțioase, identificarea acestor microorganisme este important pentru determinarea lor caracteristicile fiziopatologice și clinice importanță și pentru studii epidemiologice, și a condus la publicarea a numeroase studii analizează metodele de identificare pentru aceste bacterii (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini și colab. 1994, Renneberg și colab. 1995, Ieven 1995, de Paulis și colab. 2003)., în studiul de față, metodele modificate în laboratorul nostru au dat rezultate bune în ceea ce privește clasificarea corectă a speciilor SNC în comparație cu metoda de referință, fiind respectat acordul 100% pentru metoda modificată simplificată și acordul 99% pentru metoda disc.
metoda simplificată utilizarea sistemului de identificare a propus aici (Figura) au condus la identificarea de S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus S. capitis, și S. simulans într-un singur pas, folosind un total de șapte teste biochimice, un număr mai mic decât cel utilizat în metoda de referință (16 teste)., Deoarece S. epidermidis este cea mai frecvent izolată specie, 70 până la 90% din tulpinile (Bannerman 2003) izolate în laboratorul clinic pot fi identificate utilizând un număr redus de teste. în ceea ce privește timpul de incubație, rezultatele au arătat că 91% dintre tulpinile analizate în studiu au fermentat zahărul specific speciei în 48 h de la incubare la 37ºC., Celelalte tulpini (9%) s-au dovedit pozitive pentru fermentarea zaharurilor date după 72 h de incubare, demonstrând importanța unei incubări a testelor de fermentare a zahărului de cel puțin 72 h pentru identificarea corectă a acestor microorganisme.
identificarea S. cohnii, S. schleiferi subspecia schleiferi, S. caprae, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus, și S. lugdunensis necesară executarea a două sau trei teste biochimice suplimentare, menționată ca cel de-al doilea pas, care a variat în funcție de rezultatul obținut în prima etapă de metodă simplificată., Cu toate acestea, 20 (37,7%) tulpini care au necesitat a doua etapă pentru identificarea lor au fermentat trehaloză în 24 de ore, permițând astfel continuarea prealabilă a testelor suplimentare. Mai mult timp a fost nevoie pentru a identifica S. cohnii, S. schleiferi subspecia schleiferi și S. caprae, deoarece al doilea pas necesar pentru identificarea acestor specii incluse în reducerea nitraților test al cărui rezultat este disponibil numai după 48 de ore. Cu toate acestea, acest fapt nu duce de fapt la o întârziere în diagnosticul de CNS deoarece frecvența acestor specii în eșantioane clinice este scăzut., metoda discului s-a dovedit, de asemenea, a fi extrem de eficientă și practică, deoarece nu necesită prepararea anterioară a zaharurilor, prevenind astfel pierderea mediilor de cultură, pe lângă atingerea unui acord ridicat în identificarea CNS cu metoda de referință. API-ul comercial Staph kit a arătat cea mai mică precizie în identificarea CNS printre metodele studiate (84% acord), în acord cu studiile (Bannerman et al. 1993, Renneberg și colab. 1995). S. warneri și S. hominis au fost cele mai dificil de identificat specii. Bannerman și colab., (1993) a raportat, de asemenea, o precizie mai mică în identificarea acestor specii. În studiul lui Ieven și colab. (1995), S. hominis a fost identificat cu cea mai mică precizie de către sistemul API Id 32 Staph. Această constatare ar putea fi explicată prin lipsa testelor complementare, cum ar fi rezistența la novobiocină, creșterea anaerobă a producției de tioglicolat și hemolizină.
În cazul lui S., haemolyticus, identificarea incorectă de către sistemul API Staph ar putea fi explicată prin faptul că kitul nu sugerează producția de hemolizină ca un test complementar, care ar fi esențial pentru identificarea tulpinilor de S. haemolyticus. trei (3%) din cele 100 de tulpini analizate de sistemul API Staph au fost identificate ca S. aureus, fapt raportat și de Renneberg et al. (1995). Kitul s-a dovedit a fi ineficient în aceste cazuri, deoarece nu a solicitat rezultatul testului fundamental și cel mai larg acceptat pentru identificarea lui S. aureus, adică.,, testul de coagulază (Koneman și colab. 1997).
în conformitate cu Piccolomini și colab. (1994), acordul scăzut dintre API Staph și testul biochimic tradițional pentru identificarea SNC poate fi explicat prin utilizarea diferitelor perioade de incubație, concentrații de substrat și/sau markeri de sensibilitate.,
În concluzie, cele două metode modificate în laboratorul nostru s-au dovedit a fi extrem de eficiente pentru utilizarea de rutină din cauza lor ridicat de sensibilitate și specificitate în comparație cu metoda de referință, în plus față de a necesita mai puține teste și fiind astfel mai economic și mai rapid decât metoda standard. In ciuda faptului ca necesita un timp de incubare mai scurt (18 h), sistemul API Staph a aratat o sensibilitate mai mica in identificarea unor specii., Fără îndoială, identificarea speciilor SNC va fi facilitată și încurajată de disponibilitatea unei proceduri simple, necostisitoare și exacte, în special în locurile cu resurse limitate.
mulțumiri către bioMérieux pentru donarea kiturilor API stafilococice utilizate în studiul de față.Baker JS 1984. Compararea diferitelor metode de diferențiere a stafilococilor și micrococilor. J Clin Microbiol 19: 875-879. Bannerman TL 2003. Staphylococcus, Micrococcus și alți cocci pozitivi catalazici care cresc aerobic., În PR Murray, EJ Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller, RH Yolken (eds), Manual de Microbiologie Clinică, Societatea Americană de Microbiologie, Washington, p. 384-404. Bannerman TL, Kleeman KT, Kloos noi 1993. Evaluarea cardului de identificare Gram-pozitiv Vitek Systems pentru identificarea speciilor de stafilococi coagulazo-negativi. J Clin Microbiol 31: 1322-1325. de Paulis AN, Predari s, Chazarreta CD, Santoianni JE 2003. Schema simplă de cinci teste pentru identificarea la nivel de specie a stafilococilor coagulazo-negativi semnificativi din punct de vedere clinic. J Clin Microbiol 41: 1219-1224., Grant ce, Sewell DL, Pfaller M, Bumgardner RVS, Willians JA 1994. Evaluarea a două sisteme comerciale de identificare a stafilococului coagulazo-negativ la nivel de specie. Diag Microbiol Infect Dis 18: 1-5. Herwaldt LA, Geiss M, Kao C, Pfaller m 1996. Valoarea pozitivă a izolării stafilococilor coagulazo-negativi din culturile de sânge. Clin Infect Dis 22: 14-20.
Huebner J, Goldmann DA 1999. Stafilococi coagulazo-negativi: rolul ca agenți patogeni. Annu Rev Med 50: 223-236. Ieven M, Verhoeven J, Pattyn SR, Goossens H 1995., Metodă rapidă și economică pentru identificarea speciilor de stafilococi coagulazo-negativi semnificativi clinic. J Clin Microbiol 33: 1060-1063.
Kloos noi, Bannerman TL 1994. Actualizare privind semnificația clinică a stafilococilor coagulazo-negativi. Clin Microbiol Rev 7: 117-140. Kloos noi, Schleifer KH 1975. Schemă simplificată pentru identificarea de rutină a speciilor de stafilococi umani. J Clin Microbiol 1: 82-88. Knapp CC, Washington JA 1989., Evaluarea bulionului de trehaloză-manitol pentru diferențierea Staphylococcus epidermidis de alte specii stafilococice coagulazo-negative. J Clin Microbiol 27: 2624-2626.
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Win Jr WC 1997. Atlas de culori și Manual de Microbiologie diagnostică, a 5-a ed., Lippincott, Philadelphia, 1395 pp.
Kwok AYC, Chow AW 2003. Studiul filogenetic al speciilor de Staphylococcus și Macrococcus pe baza secvențelor genetice parțiale hsp60. Int J Syst Evol Microbiol 53: 87-92. Martin MA, Pfaller MA, Wenzel RP 1989., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern Med 110: 9-16.
Osmon DR, Sampathkumar P, Cockerill FR 2000. Prosthetic joint infection due to Staphylococcus lugdunensis. Mayo Clinic Proceedings 75: 511-512.
Perl TM, Rhomberg PR, Bale MJ, Fuchs PC, Jones RN, Koontz FP, Pfaller MA 1994. Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diag Microbiol Infect Dis 18: 151-155.
Piccolomini R, Catamo G, Picciani C, D”Antonio D 1994., Evaluarea sistemului stafilococic 18-R pentru identificarea izolatelor clinice stafilococice la nivelul speciei. J Clin Microbiol 32: 649-653. Renneberg J, Rieneck K, Gutschik e 1995. Evaluarea sistemului Staphylococcus ID și a sistemului Staphylococcus Zym pentru identificarea stafilococilor coagulazo-negativi. J Clin Microbiol 33: 1150-1153.
Sox HC 1986. Teoria probabilității în utilizarea testelor de diagnosticare. O introducere în studiul critic al literaturii. Ann Intern Med 104: 60-66.
Trülzsch K, Rinder H, Trèek J, Bader L, Wilhelm U, Heesemann J 2002., „Staphylococcus pettenkoferi”, a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diag Microbiol Infect Dis 43: 175-182.
Vuong C, Otto M 2002. Staphylococcus epidermidis infections. Microb Infect 4: 481-489.