efectele Dimetilaminoetanolului și aminoacidului compus asupra modelului de îmbătrânire a pielii indus de D-galactoză a șobolanului
Abstract
un vis de durată al ființelor umane este de a inversa sau amâna îmbătrânirea. În acest studiu, dimetilaminoetanolul (DMAE) și aminoacidul compus (AA) în mezoterapie au fost investigate pentru potențialele efecte antiaging asupra pielii îmbătrânite induse de D-galactoză. La 18 zile după inducerea D-gal, fiecare șobolan a fost tratat cu microinjecție intradermică de soluție salină, AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA sau, respectiv, 0,2% DMAE + AA., La 42 de zile după tratament, rana de piele a fost recoltată și analizată. Măsurarea grosimii epidermice și dermice în grupurile DMAE + AA 0,1% și DMAE + AA 0,2% a apărut semnificativ mai gros decât șobolanii de control al îmbătrânirii. Nu s-au constatat diferențe în conținutul de apă tisulară între grupuri. Hidroxiprolina în 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA și grupurile de control fals a fost mult mai mare decât toate celelalte grupuri. Expresia colagenului de tip I, tip III și MMP-1 a fost foarte reglată în ambele grupuri DMAE + AA 0.1% și DMAE + AA 0.2% comparativ cu controlul îmbătrânirii., În schimb, nivelurile de Expresie TIMP-1 ale diferitelor grupuri de îmbătrânire au fost reduse semnificativ în comparație cu controlul fals. Coinjecția DMAE și AA în țesutul țintă a marcat efecte antiaging asupra modelului de îmbătrânire a pielii indus de D-galactoză de șobolan.
1. Introducere
Antiaging este un subiect etern și un vis al ființei umane., Modificările cutanate legate de vârstă sunt inevitabile și includ subțierea, căderea, încrețirea, pierderea elasticității, zonele de uscăciune și o inversare a raportului de colagen de tip I/III în piele, care a prezentat o sinteză redusă a colagenului de tip I, dar producția reglementată de colagen de tip III . În prezent, mezoterapia a stârnit interesul tuturor ca strategie antiaging., Este o procedură minim invazivă, care constă în microinjecția intradermică a substanțelor farmacologice, cum ar fi substanțele nutritive, hormonii, vitaminele, enzimele și alți reactivi, care au fost diluați și sunt administrați direct în regiunea de tratat. Sub manipulare sterilă și profesională, mezoterapia provoacă foarte rar probleme de infecție a pielii și necroză, cu excepția unor riscuri minore precum umflarea și durerea în timpul injecției., Ca o procedură sigură, simplă, mai puțin dureroasă, care este una dintre așa-numitele „proceduri cosmetice la prânz”, nu necesită timp de recuperare și este perfectă pentru profesioniști și oameni de succes în viața modernă rapidă .
Dimetilaminoetanol (DMAE), un analog de vitamina B colină și un precursor al acetilcolinei, a primit mai multă atenție ca un incitant nou de ingrijire a pielii supliment astăzi pentru efectele acute ale antiaging, antiwrinkle, și fermitatea pielii. DMAE este bine cunoscut pentru utilizarea în aplicații externe., În studiile clinice randomizate, gelul facial 3% DMAE s-a dovedit a fi sigur și eficace în atenuarea liniilor frunții și a ridurilor fine periorbitale și în îmbunătățirea plinătății și formei buzelor și a aspectului general al pielii faciale . O extensie deschisă a studiului a arătat, de asemenea, că aplicarea pe termen lung a gelului DMAE timp de până la 1 an a fost asociată cu un profil de siguranță bun ., Cu toate acestea, tratamentul tropical cu DMAE necesită, de obicei, doze și concentrații mari pentru a trece prin bariera de permeabilitate epidermică, ceea ce ar putea implica preocupări legate de toxicitatea, efectele secundare și costurile medicale. S–a raportat că DMAE 2,5-10 mmol/mL ar putea determina o citopatologie vacuolară a celulelor fibroblaste umane cultivate in vitro. În plus, studiile au arătat că aplicarea 3% gel DMAE tropical ar putea suporta, de asemenea, citopatologia vacuolară a celulelor epidermice ale urechii de iepure. Administrarea alternativă a DMAE este necesară pentru a evalua eficacitatea relativă pentru îmbunătățirea îmbătrânirii pielii.,pentru a evalua potențialele efecte antiaging ale DMAE cu doze mici administrate intradermic prin microinjecție localizată (mezoterapie), structura țesuturilor și metabolismul colagenului pielii îmbătrânite induse de D-gal au fost măsurate în acest studiu. Între timp, a fost studiată și coinjecția aminoacidului compus (AA), conducând la o toxicitate celulară redusă prin injectarea DMAE și pentru a fi o sursă de nutriție locală. Mecanismul lor de acțiune considerat în piele a fost, de asemenea, descris.
2. Materiale și metode
2.1., Animalele
șobolanii masculi Wistar au fost achiziționați de la Institutul de științe farmaceutice (Qingdao, China). Toate animalele au cântărit 180-220 g la momentul intervenției chirurgicale. Îngrijirea animalelor și protocolul experimental au fost aprobate de către Spitalul afiliat al Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Qingdao Medical School.
total 80 șobolani Wistar au fost împărțiți aleatoriu în fiecare grup experimental (așa cum este detaliat în tabelul 1)., Animalelor din fiecare grup de tratament, cu excepția grupului de control fals, li s-a administrat injecție subcutanată cu D-galactoză (D-gal) în doză de 125 mg/kg·d timp de 6 săptămâni pentru a induce modelul de îmbătrânire a pielii la șobolan. La 18 zile după injectarea D-gal, fiecare șobolan a fost anesteziat cu hidrat cloral (0,25 mL la 100 g greutate corporală) și dezinfectat în zona șoldului. O zonă de tatuaj rotundă de 3 cm a fost prefabricată pe fiecare parte a șoldului șobolanului și apoi tratată sub anestezie generală o dată pe săptămână timp de 4 săptămâni cu microinjecție intradermică de soluție salină (NS), AA, 0,1% DMAE, 0,2% DMAE, 0,1% DMAE + AA sau 0.,2% DMAE + AA, respectiv. Atât grupurile de control negativ al îmbătrânirii, cât și grupurile de control fals au primit exact aceeași procedură chirurgicală, dar fără niciun tratament în studiu. La 42 de zile după tratament, toate animalele au fost eutanasiate, iar rănile cutanate au fost comparate prin histologie, măsurarea conținutului de apă, conținutul de hidroxiprolină și testarea cantitativă în timp real PCR.
2. 2. Histopatologie
grosimea pielii a fost măsurată cu software-ul de analiză a imaginii SimplePCI (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) în secțiuni colorate cu hematoxilină și eozină., Grosimea epidermică a fost măsurată de la suprafața stratului cornos (SC) până la fundul papilelor dermice, în timp ce grosimea dermică a fost măsurată de la vârful papilelor până la cele mai adânci porțiuni ale dermei reticulare până la atingerea țesutului adipos sau a mușchiului. Sub aceeași mărire, 5 poziții individuale au fost selectate aleatoriu pentru a măsura grosimea pielii din fiecare din cele 5 câmpuri de vedere pe secțiune. Cu pata de Trichrom Masson din toate secțiunile, 5 câmpuri de vedere diferite au fost, de asemenea, alese aleatoriu și analizate pentru densitatea fibrelor de colagen.
2. 3., Măsurarea conținutului de apă
1 cm2 a fost recoltată și măsurată pentru cântărirea precisă umedă, urmată de coacere la 80°C timp de 12 ore înainte de măsurarea greutății uscate. Conținutul de apă al pielii a fost calculat prin formula procentului de conținut de apă = ((greutate umedă − greutate uscată) ÷ greutate umedă) × 100%.
2. 4. Măsurarea conținutului de hidroxiprolină
conținutul de hidroxiprolină în rana pielii a fost măsurat în conformitate cu protocolul fabricării kiturilor de testare comerciale (Nanjing JIANCHEN biological engineering Co., LTD, Nanjing, China).
2, 5., Transcripția inversă cantitativă – reacția în lanț a polimerazei (qRT-PCR)
rănile cutanate au fost omogenizate în TRIzol1 (Invitrogen) și ARN-ul total a fost extras conform protocolului producătorului. 1 µg ARN total a fost transcris invers în ADNc utilizând sistemul de sinteză RT PrimeScript (Takara Biotechnology / Takara Bio, Dalian, China). O metodă PCR cantitativă extrem de sensibilă a fost efectuată cu aceste produse cDNA. Toate grundurile și sondele personalizate au fost validate pentru eficiența lor (așa cum se arată în tabelul 2)., Amestecul de reacție de 10 mL conține 2x Power Sybr1 Green PCR Master Mix, ADNc diluat de 10 ori și 0,2 mM din fiecare primer. Termice protocolul a constat din 10 de min polimeraza activare la 95°C, urmată de 40 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 30 s, grund de recoacere la 55°C timp de 1 min, și extinderea la 72°C timp de 30 s. Expresia arnm niveluri au fost normalizate la cele ale endogene de referință gena β-acțiune și prezentate ca ori schimbări cu cele obținute de imbatranire control mostre de piele.,
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.6. Statistical Analysis
Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., Rezultatele au fost considerate a fi semnificative statistic la un nivel de probabilitate de .
3. Rezultate
3.1. Modificările histologice
îmbătrânirea pielii a arătat o grosime scăzută atât pentru epidermă, cât și pentru dermă, în comparație cu șobolanii de control fals. Odată cu îmbătrânirea, epiderma și-a redus numărul de straturi celulare, iar fibrele de colagen dermic s-au transformat în rare, subțiri sau rupte. Cu toate acestea, în comparație cu controlul îmbătrânirii, aceste modificări histologice au fost ameliorate foarte mult în grupurile DMAE 0.1% + AA, DMAE 0.2% + AA și DMAE 0.2% (Figurile 1(A)-1(h)).
când este tratat cu 0, 1% DMAE + AA sau 0.,2% DMAE + AA, atât grosimea epidermică cât și dermică și densitatea fibrei de colagen au fost semnificativ crescute față de cele ale grupului de control al îmbătrânirii. În plus, 0,2% DMAE singur, de asemenea, a crescut semnificativ grosimea epidermică și densitatea fibrelor de colagen în comparație cu controlul îmbătrânirii. Dar, cu toate acestea, acești trei parametri în toate grupurile de îmbătrânire au fost mult reduse în comparație cu cei din grupul de control fals [figurile 2 (A), 2(b) și 2(c)].
3. 2. Conținutul de apă în pielea îmbătrânită
nu au existat diferențe semnificative statistic în conținutul de apă între toate grupurile [Figura 2(d)].,
3. 3. Conținutul de hidroxiprolină în pielea îmbătrânită
conținutul de hidroxiprolină a fost mult crescut în pielea îmbătrânită tratată atât cu complexul DMAE + AA de 0,1%, cât și cu complexul DMAE + AA de 0,2%, ceea ce a arătat diferențe semnificative în comparație cu toate celelalte grupuri îmbătrânite. Interesant este că conținutul de hidroxiprolină din grupul DMAE + AA 0.2% a atins un nivel echivalent cu cel al controlului fals, dar a fost semnificativ mai mare decât toate celelalte 6 grupuri de îmbătrânire. Nu a existat o diferență semnificativă între 0,1% DMAE + AA și 0,2% DMAE + AA grupuri [Figura 2 (e)].
3. 4., expresia ARNm a genelor țintă de tip I, tip III Procollagen, MMP-1 și TIMP-1
expresia colagenului de tip I a fost foarte mult reglată ca răspuns la tratamentele DMAE + AA de 0,1% și DMAE + AA de 0,2%, care nu au arătat nicio diferență semnificativă față de cea a controlului fals. Cu toate acestea, oricare dintre celelalte grupuri de îmbătrânire a arătat o expresie mult mai mică a colagenului de tip I în comparație cu șobolanii de control fals (Figura 3(a)). Când este tratat cu 0,1% DMAE + AA, 0,2% DMAE + AA sau 0.,2% DMAE singur, nivelurile de transcriere pentru colagenul de tip III au fost considerabil crescute față de grupul de control al îmbătrânirii, dar semnificativ mai mici decât controlul fals (Figura 3(b)). Ca regulator cheie potențial în îmbătrânirea pielii, mesajele MMP-1 au crescut ca răspuns fie la tratamentul DMAE + AA 0.1%, fie la tratamentul DMAE + AA 0.2%, ceea ce a arătat o diferență semnificativă statistic față de cea a controlului îmbătrânirii, dar nu la șobolanii de control fals (Figura 3(c)). În schimb, nivelurile de transcriere pentru TIMP-1 în toate grupurile de îmbătrânire au fost semnificativ reduse la un nivel mult mai scăzut decât cel al controlului fals [Figura 3 (d)].,
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., Rana de piele a fost procesată și analizată pentru exprimarea colagenului de tip I (a), colagenului de tip III (b), MMP-1 (c) și inhibitorului său și TIMP-1 (d) prin RT-PCR cantitativ. Nivelurile de Expresie pentru fiecare genă de direcționare au fost normalizate la gena de referință endogenă și raportate ca valori relative (ΔΔCt) la cele obținute din grupul de control al îmbătrânirii. și † indică o diferență semnificativă () în comparație cu grupul de control negativ (Grupul 1) și, respectiv, grupul de control fals (Grupul 8).
4., Discuție
injectarea unei doze mici de D-galactoză în pielea șobolanului ar putea induce modificări care seamănă cu îmbătrânirea accelerată. În studiile noastre, modelul îmbătrânit al șobolanului a arătat modificări ale culorii părului, scăderea activităților și afectarea neurologică. Modificările histologice ale pielii îmbătrânite induse de D-gal prezentate ca epidermă mai subțire, cu straturi de celule reduse și fibre de colagen rare, subțiri sau rupte în stratul dermic. Mai mult, această piele îmbătrânită a indicat niveluri mai scăzute de conținut de hidroxiprolină și mesaje ARNm pentru colagenul de tip I, de tip III, MMP-1 și TIMP-1 în comparație cu țesutul normal al pielii., Toate aceste date sugerează că injectarea de 125 mg/kg·d D-galactoză timp de 6 săptămâni este fezabilă din punct de vedere tehnic pentru a crea un model de îmbătrânire subacută pentru a imita pielea îmbătrânită umană .
studiile au indicat că coinjection de DMAE și AA creșterea nivelului de hidroxiprolină și conținutul de colagen de tip I expresie a D-gal induse de îmbătrânire a pielii, care a ajuns la aproximativ același nivel de normal tesutul pielii atunci când se administrează doze mari de 0,2% DMAE + AA tratament. Modificările histologice au apărut ca o grosime epidermică și dermică ridicată și fibre de colagen dermic bine aranjate., Mai interesant, Mezoterapie de coinjection de DMAE și AA foarte ridicate MMP-1 expresia genelor în procesul de îmbătrânire a pielii la un nivel echivalent de șobolani normali, dar nu pentru inhibitor de TIMP-1, care a fost semnificativ subexprimate în toate imbatranire șobolani. Aceste rezultate sugerează că mezoterapia prin coinjecția DMAE și AA a jucat o reglementare pozitivă asupra catabolismului colagenului în repararea și reconstrucția pielii îmbătrânite și întârzierea procesului de îmbătrânire a pielii., Studiile anterioare au arătat reducerea producției de colagen de tip I și creșterea sintezei colagenului de tip III și MMP-1 în pielea îmbătrânită ; cu toate acestea, rezultatele noastre au indicat că expresia ARNm pentru colagenul de tip III și MMP-1 a fost mult mai mică în controlul îmbătrânirii decât cea a șobolanilor normali. S-ar putea ca metabolismul colagenului să sufere un mod diferit între modificările normale ale pielii odată cu îmbătrânirea și modelul de îmbătrânire subacută a pielii indus de D-gal. Studiul nostru a arătat, de asemenea, că injectarea DMAE sau AA în monoterapie nu a arătat efecte asupra conținutului de hidroxiprolină sau a mesajelor pentru colagenul de tip I și MMP-1 în pielea îmbătrânită., Aceste date indică faptul că utilizarea concomitentă a DMAE și AA ar putea fi singura modalitate de a-și exercita acțiunea antiaging în acest model de piele îmbătrânită indus de D-gal, prin modularea metabolismului colagenului de tip I și remolding structura pielii îmbătrânite.studiile anterioare au arătat că fibroblastele dermice de iepure cultivate au răspuns la DMAE prin vacuolizare masivă într-o manieră dependentă de concentrație. Epiderma urechii externe a iepurelui a fost, de asemenea, îngroșată semnificativ și a prezentat umflături perinucleare clare care indică vacuolizarea ca răspuns la aplicarea topică a DMAE 3%., S-a sugerat că vacuolar citopatologie nu pot fi separate de îmbunătățire a aspectului pielii, care este produs rapid de administrate topic DMAE și ar putea fi baza celulare de antiwrinkle efect de DMAE . Din rezultatele noastre, vacuolizarea fibroblastelor dermice ar putea apărea atât în pielea îmbătrânită tratată cu 0,1%, cât și în 0,2% DMAE, ducând la umflarea celulară și creșterea densității fibrelor de colagen. Celulele epiteliale ale pielii îmbătrânite ar putea răspunde, de asemenea, la concentrația mai mare de 0,2% DMAE prin vacuolizare, care a prezentat o grosime epidermică crescută., Cu toate acestea, acestea ar putea necesita studii suplimentare pentru a clarifica această problemă.în plus, măsurarea conținutului de apă din piele nu a arătat diferențe între toți șobolanii tratați, ceea ce sugerează că DMAE și compusul AA au avut efecte limitate asupra hidratării pielii. Acest lucru se poate datora unui nivel mai scăzut al concentrației și unei perioade de acțiune mai scurte a DMAE disponibile local în stratul epidermic atunci când s-a utilizat injecția subcutanată directă pentru administrarea DMAE, care diferă de aplicarea topică a DMAE.
5., Concluzii
cu modelul de îmbătrânire indus de D-galactoză al șobolanului, mezoterapia prin livrarea DMAE și AA direct la țesutul țintă a marcat efecte antiaging prin promovarea sintezei de colagen și a catabolismului pentru remodelarea texturii pielii și îmbunătățirea grosimii pielii îmbătrânite. Deși aceste experimente au folosit un model de șobolan, rezultatele sunt relevante pentru lucrările clinice., Investigații suplimentare pentru a înțelege mecanismul acțiunii dimetilaminoetanolului și a aminoacidului compus în îmbătrânirea pielii vor ajuta la dezvoltarea și testarea regimurilor de îngrijire a pielii mai puternice și mai eficiente pentru evaluarea umană ulterioară.
Conflict de interese
autorii declară că nu există conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.