Numărarea celulelor folosind un hemocitometru
Figura 1. Linii de grilă pentru hemocitometru.
diagrama Hemocitometrului care indică unul dintre seturile de 16 pătrate care ar trebui utilizate pentru numărare.numărarea celulelor permite determinarea exactă a numărului de celule și, prin urmare, coerența între experimente. Acest videoclip va schița procedura de numărare a celulelor de suspensie și de aderență folosind un hemocitometru.înainte de a începe lucrul, pulverizați bine interiorul dulapului de siguranță cu flux laminar cu dezinfectant și ștergeți-l cu țesut., Aruncați țesutul utilizat în coșul de gunoi corespunzător. Apoi, pulverizați interiorul hotei cu 70% etanol și ștergeți cu țesut. Hota este acum curată și gata de utilizare. Scoateți mediile de cultură celulară și tripsina din frigider și puneți-le într-un incubator umidificat, de 37 de grade C, cu dioxid de carbon, pentru a se încălzi. Între timp, uitați-vă la celulele care trebuie numărate folosind un microscop pentru a verifica orice semne vizuale de contaminare bacteriană și fungică. Pulverizați sticlele și pipeta cu etanol 70% înainte de a juca în dulapul de siguranță cu flux laminar.,pentru celulele în suspensie, agitați ușor vasul pentru a vă asigura că celulele sunt bine amestecate. Înainte de a avea ocazia să se așeze, luați o probă de 0,5 mililitri de suspensie celulară și pipetați într-un tub steril eppendorf. Pentru celulele de aderență, îndepărtați mediile existente, spălați cu PBS la temperatura camerei și adăugați tripsină EDTA pentru a detașa celulele. Consultați tabelul unu pentru volumele de PBS și tripsină necesare. Incubați celulele timp de două până la cinci minute în incubatorul umidificat de 37 de grade C, dioxid de carbon. Timpul de incubare va trebui optimizat pentru tipul de celulă., Când toate celulele sunt detașate, neutralizați tripsina EDTA cu ser cald care conține medii de creștere adecvate celulelor și culturii. Consultați tabelul unu pentru volumele necesare.
re-suspendați celulele prin pipetarea ușoară a suspensiei celulare în sus și în jos de trei ori și transferați-le într-un tub de 50 mililitri. Centrifugați suspensia celulară timp de cinci minute la 1.000 de rotații pe minut la temperatura camerei., Îndepărtați supernatantul utilizând o pipetă serologică sterilă și re-suspendați paleta celulară cu ser C de 37 de grade care conține medii de creștere până la volumul inițial al culturii inițiale. Folosind o pipetă sterilă de cinci mililitri, luați și o probă de 0,5 mililitri de suspensie celulară și transferați într-un tub steril eppendorf.pentru a număra, pregătiți hemocitometrul de unică folosință. Folosind o pipetă Gilson P2000, luați 100 microlitri de suspensie și adăugați la 400 microlitri de albastru trypan, notați, .08% și se amestecă bine., Luați 100 microlitri de amestec de suspensie de celule albastre trypan și pipetați cu atenție o picătură de suspensie în puțul camerei de numărare, permițând acțiunea capilară pentru a extrage proba. Aveți grijă să nu supraîncărcați camera de numărare. Vizualizați zona de numărare sub o mărire de 10 ori folosind un microscop inversat. Folosind microscopul, concentrați – vă pe una dintre cele patru câte patru grile de pe hemocitometru și numărați celulele la un negativ pentru albastru tripan. Acestea sunt viabile. De asemenea, notați câte celule au fost pozitive pentru trypan blue., Aceste celule sunt moarte, iar acest număr poate fi utilizat ulterior pentru a calcula viabilitatea procentuală a culturii, dacă este necesar.
când numărați, utilizați un sistem prin care celulele sunt numărate numai atunci când se află într-un pătrat sau pe linia dreaptă sau de jos. Înregistrați numărul de celule numărate în acest set de 16 pătrate și mutați hemocitometrul până când toate cele patru seturi de 16 pătrate de pe hemocitometru au fost numărate și valorile lor înregistrate., Pentru a calcula concentrația celulelor, luați numărul mediu de celule viabile în cele patru seturi de 16 pătrate și înmulțiți cu 10.000 pentru a obține numărul de celule pe mililitru. Apoi, înmulțiți acest lucru cu cinci pentru a corecta diluția din cinci din adăugarea trypan blue. Această valoare finală este numărul de celule viabile pe mililitru în suspensia celulară inițială.,de exemplu, dacă numărul de celule viabile este de 200.000 de celule pe mililitru într-un volum de 20 mililitri și doriți să vedeți 10.000 de celule în noul balon, atunci trebuie să transferați 50 de microlitri de suspensie celulară în noul balon. Transferați volumul necesar de suspensie celulară în noul balon. Completați cu suporturi și puneți-le în incubator.