rezoluția microscopului :concepte, factori și calcul
luând în considerare toate teoriile de mai sus, este clar că există o serie de factori de luat în considerare la calcularea limitelor teoretice ale rezoluției. Rezoluția depinde, de asemenea, de natura eșantionului. Să ne uităm la calcularea rezoluției folosind limita de difracție a lui Abbe și, de asemenea, folosind criteriul Rayleigh., în primul rând, trebuie amintit că: NA= N x sin α
unde n este indicele de refracție al mediului imagistic și α este jumătate din deschiderea unghiulară a obiectivului. Deschiderea unghiulară maximă a unui obiectiv este de aproximativ 144º. Sinusul jumătății acestui unghi este de 0,95. Dacă se utilizează un obiectiv de imersie cu ulei care are un indice de refracție de 1,52, na maxim al obiectivului va fi de 1,45. Dacă se utilizează un obiectiv „uscat” (fără imersie), NA maxim al obiectivului va fi de 0,95 (deoarece aerul are un indice de refracție de 1,0).
formula de difracție a lui Abbe pentru lateral (adică., XY) rezoluția este:
d= λ/2 NA
unde λ este lungimea de undă a luminii folosită pentru imaginea unui specimen. Dacă se utilizează o lumină verde de 514 nm și un obiectiv de imersie în ulei cu un NA de 1, 45, atunci limita (teoretică) de rezoluție va fi de 177 nm.formula de difracție a lui Abbe pentru rezoluția axială (adică Z) este:
d= 2 λ/NA2
Din nou, dacă presupunem o lungime de undă de 514 nm pentru a observa un specimen cu un obiectiv de valoare NA de 1, 45, atunci rezoluția axială va fi de 488 nm.criteriul Rayleigh este o formulă ușor rafinată bazată pe limitele de difracție ale lui Abbe:
R= 1.,22 λ/NAobj+NAcond
unde λ este lungimea de undă a luminii folosită pentru imaginea unui specimen. NAobj este NA obiectivului. NAcond este NA condensatorului. Cifra de „1.22” Este o constantă. Acest lucru este derivat din munca lui Rayleigh asupra funcțiilor Bessel. Acestea sunt utilizate pentru calcularea problemelor în sisteme precum propagarea undelor.luând în considerare NA-ul condensatorului, aerul (cu un indice de refracție de 1,0) este, în general, mediul imagistic dintre condensator și diapozitiv. Presupunând că condensatorul are o deschidere unghiulară de 144º, atunci valoarea NAcond va fi egală cu 0,95.,dacă se utilizează o lumină verde de 514 nm, un obiectiv de imersie în ulei cu un NA de 1, 45, condensator cu un NA de 0, 95, atunci limita (teoretică) de rezoluție va fi de 261 nm.după cum sa menționat mai sus, cu cât lungimea de undă a luminii este mai scurtă pentru imaginea unui specimen, cu atât mai multe detalii vor fi rezolvate. Deci, dacă se utilizează cea mai scurtă lungime de undă vizibilă de lumină de 400 nm, cu un obiectiv de imersie în ulei cu un NA de 1, 45 și un condensator cu un NA de 0, 95, atunci R ar fi egal cu 203 nm., pentru a obține rezoluția maximă (teoretică) într-un sistem de microscop, fiecare dintre componentele optice trebuie să fie de cea mai mare NA disponibilă (luând în considerare deschiderea unghiulară). În plus, folosind o lungime de undă mai scurtă de lumină pentru a vizualiza specimenul va crește rezoluția. În cele din urmă, întregul sistem de microscop trebuie aliniat corect.