effekter av dimetylaminoetanol och sammansatt aminosyra på D-Galaktosinducerad Hudåldringsmodell av råtta
Abstrakt
en varaktig dröm om människor är att vända eller skjuta upp åldrandet. I denna studie undersöktes dimetylaminoetanol (DMAE) och förening aminosyra (AA) i mesoterapi för deras potentiella antiagingseffekter på D-galaktosinducerad åldrande hud. Vid 18 dagar efter d-gal-induktion behandlades varje råtta med intradermal mikroinjektion av saltlösning, AA, 0, 1% DMAE, 0, 2% DMAE, 0, 1% DMAE + AA respektive 0, 2% DMAE + AA., Vid 42 dagar efter behandlingen skördades och analyserades hudsåret. Mätning av epidermal och dermal tjocklek i 0.1% DMAE + AA och 0.2% DMAE + AA grupper verkade betydligt tjockare än åldrande kontroll råttor. Inga skillnader hittades i vävnadsvattenhalt bland grupper. Hydroxiprolin i 0.1% DMAE + AA, 0.2% DMAE + AA och sham kontrollgrupper var mycket högre än alla andra grupper. Kollagen typ i, typ III och MMP-1-uttryck var mycket uppreglerat i både 0.1% DMAE + AA och 0.2% DMAE + AA-grupper jämfört med åldringskontroll., I kontrast, TIMP – 1 uttryck nivåer av olika åldrande grupper reducerades signifikant jämfört med sham kontroll. Coinjection av DMAE och AA till målvävnad har markerat antiaging effekter på D-galaktosinducerad hudåldringsmodell av råtta.
1. Inledning
Antiaging är ett evigt ämne och dröm om människan., Åldersrelaterade hudförändringar är oundvikliga och inkluderar gallring, sagging, rynkning, förlust av elasticitet, områden av torrhet och en inverterad omsättning av kollagen typ I/III-förhållande i huden som presenteras som Minskad syntes av kollagen typ i men uppreglerad produktion av kollagen typ III . För närvarande Mesotherapy har väckt allas intresse som en antiaging strategi., Det är ett minimalt invasivt förfarande, som består av intradermal mikroinjektion av farmakologiska ämnen, såsom näringsämnen, hormoner, vitaminer, enzymer och andra reagenser, som har utspätt och administreras direkt i den region som ska behandlas. Under steril och professionell manipulation orsakar mesoterapi mycket sällan problem med hudinfektion och nekros, förutom några mindre risker som svullnad och smärta under injektionen., Som en säker, enkel, mindre smärtsam procedur som är en av de så kallade ”lunchtid kosmetiska förfaranden”, det kräver ingen återhämtning tid och är perfekt för proffs och framgångsrika människor i den snabba moderna livet .
dimetylaminoetanol (DMAE), en analog av B-vitaminkolin och en föregångare till acetylkolin, har fått mer uppmärksamhet som ett spännande nytt hudvårdstillskott idag för dess akuta effekter av antiaging, antiwrinkle och hudfasthet. DMAE är välkänt för användning i extern applikation., I de randomiserade kliniska studierna har 3% DMAE ansiktsgel visat sig vara säker och effektiv vid lindring av pannlinjer och periorbitala fina rynkor och för att förbättra läppens fullhet och form och det övergripande utseendet på ansiktshud . En öppen förlängning av försöket visade också att den långsiktiga tillämpningen av DMAE gel i upp till 1 år var förknippad med en bra säkerhetsprofil ., Men tropisk behandling med DMAE kräver vanligtvis hög dos och koncentration för att passera genom epidermal permeabilitetsbarriär, vilket kan medföra oro för dess toxicitet, biverkningar och medicinska kostnader. Det rapporterades att 2, 5-10 mmol/mL DMAE kan orsaka en vakuolär cytopatologi av in vitro odlade humana fibroblastceller. Dessutom visade studier att applicering av 3% DMAE gel tropiskt också kan medföra vakuolär cytopatologi hos epidermala celler i kaninörat. Alternativ leverans av DMAE behövs för att utvärdera den relativa effekten för förbättring av åldrande hud.,
för att utvärdera potentiella antiaging effekter av lågdos DMAE administreras intradermalt genom lokaliserad mikroinjektion (Mesotherapy), vävnadsstruktur och kollagenmetabolism av D-gal inducerad åldrande hud mättes i denna studie. Samtidigt studerades coinjection av förening aminosyra (AA), vilket ledde till en minskad cellulär toxicitet genom DMAE-injektion och att vara en lokal näringstillförsel. Deras övervägda verkningsmekanism i huden beskrevs också.
2. Material och metoder
2.1., Djur
– Hane Wistar råttor köptes från Institute of pharmaceutical Sciences (Qingdao, Kina). Alla djur viktade 180-220 g vid tidpunkten för operationen. Djurvård och experimentellt protokoll godkändes av det Anslutna sjukhuset i Qingdao University Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.
totalt 80 Wistar-råttor delades slumpmässigt in i varje försöksgrupp (enligt Tabell 1)., Djur från varje behandlingsgrupp, utom sham control group, gavs subkutan injektion med d-galaktos (d-gal) i dosen 125 mg/kg·D i 6 veckor för att inducera hudåldringsmodellen för råtta. Vid 18 dagar efter d-gal-injektionen bedövades varje råtta med kloralhydrat (0, 25 mL per 100 g kroppsvikt) och desinficerades inom höftområdet. Ett 3 cm runt tatueringsområde prefabricerades på varje sida av råttans höft och behandlades sedan under generell anestesi en gång i veckan i 4 veckor med intradermal mikroinjektion av saltlösning (NS), AA, 0.1% DMAE, 0.2% DMAE, 0.1% DMAE + AA eller 0.,2% DMAE + AA. Både åldrande negativ kontroll och sham kontrollgrupper fick exakt samma kirurgiska ingrepp men utan någon behandling som studeras. Vid 42 dagar efter behandlingen eutaniserades alla djur och hudsår jämfördes med histologi, mätning av vattenhalt, hydroxiprolinhalt och kvantitativ realtids-PCR-testning.
2.2. Histopatologi
hudtjocklek mättes med SimplePCI image analysis software (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) i sektioner färgade med Hematoxylin och eosin., Epidermal tjocklek mättes från stratum corneum (SC) yta till botten av dermal papiller, medan dermal tjocklek mättes från toppen av papiller till de djupaste delarna av retikulära dermis tills fettvävnad eller muskel uppnåddes. Under samma förstoring valdes 5 enskilda positioner slumpmässigt för att mäta hudtjockleken från var och en av 5 synfält per sektion. Med Masson Trichrome fläck av alla sektioner, 5 olika synfält valdes också slumpmässigt och analyserades för kollagenfiberdensitet.
2.3., Mätning av vattenhalt
1 cm2 hudsår skördades och mättes för exakt våtvikt, följt av bakning vid 80°C i 12 timmar innan dess torrvikt mättes. Hudvattenhalten beräknades med formeln för procentandelen vattenhalt = ((våt vikt − torrvikt) våt vikt) × 100%.
2, 4. Mätning av Hydroxiprolinhalten
Hydroxiprolinhalten i hudsår mättes enligt tillverkningsprotokollet för kommersiella analyssatser (NANJING JIANCHEN biological engineering Co. LTD , Nanjing, Kina).
2, 5., Kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR)
hudsår homogeniserades i TRIzol1 (Invitrogen) och total RNA extraherades enligt tillverkarens protokoll. 1 µg total RNA transkriberades omvänt till cDNA med hjälp av det ursprungliga RT-Syntessystemet (Takara Biotechnology/Takara Bio, Dalian, Kina). En mycket känslig kvantitativ PCR-metod utfördes med dessa cDNA-produkter. Alla anpassade primrar och sonder validerades för deras effektivitet (som visas i Tabell 2)., 10 mL reaktionsblandningen innehöll 2x Power SYBR1 Green PCR Master Mix, 10-faldig utspädd cDNA och 0,2 mM av varje primer. Det termiska protokollet bestod av 10 min polymerasaktivering vid 95 ° C, följt av 40 cykler av denaturering vid 95 ° C för 30 s, primer glödgning vid 55 ° C för 1 min, och förlängning vid 72 ° C för 30 s. mRNA uttryck nivåerna normaliserades till de av den endogena referensgenen β-action och presenteras som vik förändringar till de som erhållits från åldrande kontroll hudprover.,
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.6. Statistical Analysis
Data were expressed as means ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS17.0 software., Resultaten ansågs vara statistiskt signifikanta vid en sannolikhetsnivå för .
3. Resultat
3.1. Histologiska förändringar
åldrande hud visade minskad tjocklek för både epidermis och dermis jämfört med sham kontroll råttor. Med åldrande minskade epidermis sitt antal cellskikt, och de dermala kollagenfibrerna blev glesa, smala eller brutna. Jämfört med åldringskontroll förbättrades emellertid dessa histologiska förändringar kraftigt i 0.1% DMAE + AA, 0.2% DMAE + AA och 0.2% DMAE-grupper(Figur 1(A)-1 (h)).
vid behandling med 0, 1% DMAE + AA eller 0.,2% DMAE + AA, både epidermal och dermal tjocklek och densitet av kollagenfiber var signifikant förhöjda över de av åldrande kontrollgruppen. Dessutom ökade 0,2% DMAE ensam också signifikant epidermal tjocklek och densitet av kollagenfiber jämfört med åldringskontroll. Men dessa tre parametrar i alla åldringsgrupper var ändå kraftigt nedreglerade jämfört med sham control group (figurerna 2(a), 2(b) och 2(c)).
3.2. Vattenhalten i åldrande hud
det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader i vattenhalten bland alla grupper (Figur 2(D)).,
3.3. Hydroxiprolinhalten i åldrande hud
Hydroxiprolinhalten ökade kraftigt i åldrande hud behandlad med både 0.1% DMAE + AA och 0.2% DMAE + AA-komplexet, vilket visade signifikanta skillnader jämfört med alla andra åldringsgrupper. Intressant nådde hydroxiprolinhalten i 0.2% DMAE + AA-gruppen en motsvarande nivå som för sham control men var signifikant högre än alla andra 6-åldringsgrupper. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan 0, 1% DMAE + AA och 0, 2% DMAE + AA-grupper (Figur 2(e)).
3.4., mRNA uttryck av typ i, typ III prokollagen, MMP-1, och TIMP-1 målgener
kollagen typ i uttryck var kraftigt uppreglerade som svar på både 0.1% DMAE + AA och 0.2% DMAE + AA behandlingar, som visade ingen signifikant skillnad till sham kontroll. Men någon av de andra åldrande grupperna visade mycket mindre uttryck av kollagen typ i jämfört med sham kontroll råttor(Figur 3 (a)). Vid behandling med 0.1% DMAE + AA, 0.2% DMAE + AA, eller 0.,2% DMAE ensam, transkriptionsnivåer för kollagen typ III var signifikant förhöjda över åldrande kontrollgrupp, men betydligt mindre än sham kontroll(Figur 3 (B)). Som en potentiell nyckelregulator i hudåldring ökade MMP-1-meddelanden som svar på antingen 0.1% DMAE + AA eller 0.2% DMAE + AA-behandling, vilket visade en statistiskt signifikant skillnad från åldringskontrollen, men inte sham control rats(Figur 3 (C)). Däremot minskade transkriptnivåerna för TIMP-1 i alla åldringsgrupper betydligt till en mycket lägre nivå av sham-kontrollen(Figur 3 (D)).,
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Measurement for collagen metabolism of D-gal induced aging skin after each treatment., Hudsår bearbetades och analyserades för uttryck av kollagen typ i (a), kollagen typ III (B), MMP-1 (C) och dess hämmare och TIMP-1 (d) genom kvantitativ RT-PCR. Expressionsnivåer för varje målgen normaliserades till endogen referensgen och rapporterades som relativa värden (ΔΔCt) till de som erhölls från åldrande kontrollgrupp. och † indikerar en signifikant skillnad () jämfört med negativ kontroll (grupp 1) respektive sham-kontroll (Grupp 8).
4., Diskussion
injektion av lågdos d-galaktos i råtthud kan inducera förändringar som liknar accelererad åldrande. I våra studier visade den åldrande modellen av råtta Hårfärg förändringar, minskade aktiviteter och neurologisk försämring. De histologiska förändringarna av D-gal inducerad åldrande hud presenteras som tunnare epidermis med reducerade celler skikt och glesa, smala eller brutna kollagenfibrer i dermalt skikt. Dessutom indikerade denna åldrande hud lägre nivåer av hydroxiprolininnehåll och mRNA-meddelanden för typ i, typ III-kollagen, MMP-1 och TIMP-1 jämfört med normal hudvävnad., Alla dessa data tyder på att injektion av 125 mg / kg·d d-galaktos för 6 veckor är tekniskt möjligt att skapa en subakut åldringsmodell för att efterlikna mänsklig åldrande hud .
våra studier visade att coinjection av DMAE och AA ökade nivåerna av hydroxiprolininnehåll och kollagen typ i-uttryck av D-gal inducerad åldrande hud, som nådde ungefär samma nivå av normal hudvävnad när den gavs hög dos av 0.2% DMAE + AA-behandling. De histologiska förändringarna uppträdde som förhöjd epidermal och dermal tjocklek och tätt anordnade dermala kollagenfibrer., Mer intressant, mesotherapy av coinjection av DMAE och AA kraftigt förhöjd MMP-1 genuttryck i åldrande hud till en motsvarande nivå av normala råttor, men inte för dess inhibitor av TIMP-1 som var signifikant nedreglerad i alla åldrande råttor. Dessa resultat tyder på att Mesotherapy av coinjection av DMAE och AA spelade en positiv reglering på kollagen katabolism vid reparation och rekonstruktion av åldrande hud och fördröja åldrandet av huden., Tidigare studier visade minskad produktion av kollagen typ i och ökad syntes av kollagen typ III och MMP-1 i åldrande hud ; Våra resultat visade dock att mRNA uttryck för kollagen typ III och MMP-1 var mycket mindre i åldrande kontroll än för normala råttor. Det kan vara att kollagenmetabolism genomgår ett annat sätt mellan normala hudförändringar med åldrande och d-gal-inducerad subakut hudåldringsmodell. Vår studie visade också att injektion av DMAE eller AA ensam visade inga effekter på hydroxiprolininnehåll eller meddelanden för typ i kollagen och MMP-1 i åldrande hud., Dessa data tyder på att samtidig användning av DMAE och AA kan vara det enda sättet att utöva sina antiaging åtgärder i denna D-gal inducerad åldrande hud modell, genom att modulera kollagen typ i ämnesomsättningen och remolding strukturen för åldrande hud.
tidigare studier har visat att Odlade kanindermala fibroblaster svarade på DMAE genom massiv vakuolisering på ett koncentrationsberoende sätt. Epidermis hos kaninens yttre öra var också signifikant förtjockad och uppvisade klar perinukleär svullnad som indikerar vakuolisering som svar på topisk applicering av 3% DMAE., Det föreslogs att vakuolär cytopatologi kanske inte är dissociativ från förbättringen av hudens utseende som snabbt produceras av lokalt administrerad DMAE och kan vara den cellulära grunden för antiwrinkle-effekten av DMAE . Från våra resultat kan vakuoliseringen av dermal fibroblast förekomma i både 0.1% och 0.2% DMAE behandlad åldrande hud, vilket resulterar i cellulär svullnad och ökad kollagenfiberdensitet. Epitelceller av åldrande hud kan också svara på den högre koncentrationen av 0,2% DMAE genom vakuolisering, som presenteras som ökad epidermal tjocklek., Dessa kan dock behöva ytterligare studier för att klargöra denna fråga.
dessutom visade mätningen av hudvattenhalten inga skillnader mellan alla behandlade råttor, vilket tyder på att DMAE och förening AA hade begränsade effekter på hudfuktning. Detta kan bero på en lägre koncentrationsnivå och kortare aktionsperiod för lokal tillgänglig DMAE i epidermalt skikt när direkt subkutan injektion användes för DMAE-leverans, vilket skiljer sig från topisk applicering av DMAE.
5., Slutsatserna
Med D-galaktos inducerad åldrande modell av råtta, Mesotherapy genom att leverera DMAE och AA direkt till målvävnaden har märkt antiaging effekter genom att främja kollagen syntes och katabolism att renovera hudens struktur och förbättra tjockleken på åldrande hud. Även om dessa experiment använde en råttmodell är resultaten relevanta för kliniska verk., Ytterligare undersökningar för att förstå mekanismen för verkan av dimetylaminoetanol och sammansatt aminosyra i åldrande hud kommer att bidra till utvecklingen och testet av mer kraftfulla och effektiva hudvårdsregimer för ytterligare mänsklig utvärdering.
intressekonflikt
författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller offentliggörandet av detta dokument.