metoder för identifiering av koagulasnegativa stafylokocker
BIOKEMI KARAKTERISERING
Jämförelse av metoder för identifiering av koagulasnegativa stafylokocker
Maria de Lourdes RS CunhaI,1; Yuri K SinzatoI; Liciana VA SilveiraII
IDepartamento de Microbiologia e Imunologia
IIDepartamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000 Botucatu, SP-Brasil
SAMMANFATTNING
koagulasnegativa stafylokocker (CNS) artidentifiering är fortfarande svårt för de flesta kliniska laboratorier., Det system som föreslås av Kloos och Schleifer och modifieras av Bannerman är den referensmetod som används för identifiering av stafylokockarter och underarter; denna metod är dock relativt mödosam för rutinmässig användning eftersom det kräver användning av ett stort antal biokemiska tester. Syftet med denna studie var att jämföra fyra metoder, dvs. referensmetoden, API Staph-systemet (bioMérieux) och två metoder modifierade från referensmetoden i vårt laboratorium (förenklad metod och diskmetod), vid identifiering av 100 CNS-stammar., Jämfört med referensmetoden identifierade den förenklade metoden och diskmetoden 100 respektive 99% av CNS-arterna korrekt, medan denna sats var 84% för API Staph-systemet. Felaktig identifiering med API Staph-metoden observerades för Staphylococcus epidermidis (2.2%), S. hominis (25%), S. haemolyticus (37.5%) och S. warneri (47.1%)., Den förenklade metoden med det enkla identifieringssystem som föreslogs i denna studie visade sig vara effektiv för alla testade stammar, med 100% känslighet och specificitet och visade sig vara tillgängliga alternativ för identifiering av stafylokocker, erbjudande, högre tillförlitlighet och lägre kostnad än de för närvarande tillgängliga kommersiella systemen. Denna metod skulle vara mycket användbar i klinisk mikrobiologi laboratorium, särskilt på platser med begränsade resurser.,
nyckelord: koagulas-negativa stafylokocker-metoder-identifiering-API Staph
fyrtio arter av släktet Staphylococcus har hittills identifierats (Trülzsch et al. 2002, Bannerman 2003, Kwok & Chow 2003, Spergser et al. 2003). S., aureus, en koagulaspositiv art som producerar en serie andra enzymer och toxiner, är den mest kända och har ofta varit inblandad i etiologin av en serie infektioner och förgiftningar hos djur och människor, medan koagulasnegativa stafylokocker (CNS), som representerar majoriteten av arterna, har ansetts vara saprofytiska eller sällan patogena (Kloos & Schleifer 1975)., Under det senaste decenniet har emellertid CNS erkänts som etiologiska medel för en serie smittsamma processer, som representerar de mikroorganismer som oftast isolerats från blododlingar (Huebner & Goldmann 1999).
ungefär hälften av CNS-arterna koloniserar naturligt människor, och för närvarande anses de i huvudsak opportunistiska etiologiska medel, som råder i många organiska situationer för att producera allvarliga infektioner (Bannerman 2003)., Framväxten av CNS som patogener av olika infektioner kan vara resultatet av den ökande användningen av invasiva procedurer såsom intravaskulära katetrar och proteser hos patienter som genomgår intensiv behandling, immunkompromiserade patienter, för tidiga barn, patienter med neoplasier och transplantationspatienter (Kloos & Bannerman 1994).
de arter som oftast orsakar sjukdomar hos människor är S., epidermidis (bakteriemi, infektioner på grund av implanterade medicintekniska produkter såsom proteser och katetrar, infektion av kirurgiska sår, peritonit hos patienter på kontinuerlig peritonealdialys, osteomyelit, endoftalmit etc.), S. haemolyticus (endokardit, peritonit, septikemi och infektioner i urinvägarna, sår, ben och leder) och S. saprophyticus (urininfektioner och septikemiska processer). Andra signifikanta opportunistiska patogener inkluderar S. hominis, S. warneri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii, S. xylosus och S. saccharolyticus (Bannerman 2003). S., lugdunensis verkar vara associerad med endokardit efter implantation av protesventiler, med peritonit, med mjukvävnadsinfektion och med vertebral osteomyelit (Osmon et al. 2000).
med tanke på den kända patogena potentialen hos CNS inom sjukhusmiljön har intresset för olika arter relaterade till infektion och deras toxigena potential och virulens ökat under det senaste decenniet och har lett till publicering av olika studier om dessa aspekter., Trots den växande karakteriseringen av CNS-infektioner identifieras dessa mikroorganismer inte i kliniska mikrobiologiska laboratorier. Det system som föreslagits av Kloos och Schleifer (1975) och modifierats av Bannerman (2003) är den metod som konventionellt används.denna metod är dock relativt mödosam för rutinanvändning eftersom ett stort antal biokemiska tester krävs., I de flesta rutinlaboratorier identifieras stafylokocker baserat på morfologiska aspekter av kolonierna, gramfärgning och katalas-och koagulasproduktion, vilket endast tillåter klassificering av stafylokocker i S. aureus och non-S. aureus isolat, med den senare helt enkelt klassificeras som CNS.
utvecklingen av metoder för identifiering av stafylokockarter och underarter gör det möjligt för kliniker att få information om de olika CNS som finns i kliniska prover och att betrakta dem som etiologiska medel för smittsamma processer., Noggrann identifiering av CNS är nödvändig för att få en tidig förutsägelse av den potentiella patogeniciteten eller antibiotikakänsligheten hos varje kliniskt isolat och för att klargöra den kliniska betydelsen av varje art. Upprepa CNS-isolat från patienter med invasiva sjukdomar bör identifieras för att möjliggöra en jämförelse av stammarna. Å andra sidan är artidentifiering en förutsättning innan maskinskrivning för epidemiologiska studier genomförs.,
under de senaste åren har flera kommersiella system för snabb identifiering av stafylokocker utvecklats som ett alternativ till de klassiska identifieringsprotokollen (Bannerman 2003). Dessa diagnostiska system utgör emellertid problem som kostnad och inkubationstid, vilket ofta ger opålitliga resultat (Grant et al. 1994, Perl et al. 1994). Dessutom var många av dessa kit utformade för identifiering av alla kända CNS-arter (dvs kliniska, veterinära och alimentariska isolat) och är därför inte särskilt specifika., Baserat på det ovan anförda och mot bakgrund av behovet av snabba, enkla och tillförlitliga metoder, syftet med den aktuella studien var att jämföra fyra tekniker för identifiering av CNS, dvs, en referensmetod (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman (2003), den kommersiella API Staph system, och två metoder modifierad från referens metod i vårt laboratorium för att utveckla alternativa metoder för identifiering som kombinerar enkelhet, tillförlitlighet och låg kostnad, särskilt till ställen med begränsade resurser.,
material och metoder
isolat – hundra CNS-isolat erhållna från kliniska prover av patienter på sjukhus vid Universitetssjukhuset vid Medicinska fakulteten, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu Campus, studerades. Stammar isolerades enligt beskrivningen av Koneman et al. (1997).
identifiering av CNS – de isolat som erhölls från kliniska prover pläterades på blod agar och gram färgas för att garantera deras renhet och bevarandet av deras morfologi och specifik färgning., Efter bekräftelse av dessa egenskaper lämnades isolaten till katalas-och koagulastesterna. Staphylococcus differentierades från Mikrokockus arter på grundval av oxidation och jäsning av glukos, resistens mot bacitracin (0,04 U) indikeras genom frånvaro av en inhibering halo eller närvaro av en inhibering halo som mäter upp till 9 mm i diameter, och känslighet för furazolidon (100 µg) kännetecknas av inhiberingszoner som mäter 15 till 35 mm i diameter (Baker 1984).
de fyra metoder som beskrivs nedan användes för identifiering av CNS., Följande internationell referens CNS stammar användes som kontroller: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979), och S. saprophyticus (ATCC 15305).,
referensmetod föreslagen av Kloos och Schleifer (1975) och Bannerman (2003) – denna metod består av en uppsättning biokemiska tester som bestämmer utnyttjandet av sockerarterna xylos, arabinos, sackaros, trehalos, maltos, mannitol, laktos, xylitol, ribos, fruktos och mannos, produktion av hemolysin, nitratreduktion, närvaro av ureas och ornitindekarboxylas och resistens mot novobiocin kännetecknad av en inhiberingshaloo på upp till 16 mm. avläsningar av de tester erhölls efter 24, 48 och 72 h inkubation vid 37ºC i en luftinkubator. ,
API Staph-API Staph-systemet (bioMérieux) är ett färdigt testbatteri som består av 20 biokemiska tester till vilka en homogen bakteriell suspension vid 0,5 McFarland grumlighet tillsätts. Efter 24 h inkubering vid 37ºC och tillägg av VP (VP1 och VP2), NIT (NIT1 och NIT2) och PAL (ZYM EN och ZYM B) reagenser som medföljer satsen, reaktionerna blev tolkas och mikroorganismer identifierades med hjälp av den analytiska katalog., Identifieringen baseras på ett numeriskt system bestående av sju siffror som ger procent identifiering (%ID), med ett värde > 80% är acceptabelt.
modifierade metoder – två identifieringsmetoder som modifierats i vårt laboratorium användes (förenklad metod och diskmetod). Den förenklade metoden delades in i två steg. Under det första steget testades jäsning av xylos, sackaros, trehalos, maltos och mannitol, produktion av hemolysin och anaerob tillväxt i tioglykolat (tabell i)., De tester som användes i det andra steget varierade beroende på de resultat som erhölls i det första identifieringssteget efter 72-timmars inkubation vid 37ºC. De kompletterande tester som användes under det andra steget (vid behov) anges i tabell II.
diskmetoden bestod av följande tester: jäsning av arabinos, sackaros, trehalos, maltos, mannitol och laktos, nitratreduktion, produktion av hemolysin, test för ureas och ornitindekarboxylas och resistens mot novobiocin., För sockerjäsningstestet placerades kommersiellt tillgängliga skivor specifika för varje socker i rör innehållande 2,5 ml lila Buljongbasmedium. Bakteriesuspensioner inokulerades som beskrivet av Kloos och Schleifer (1975). Avläsningar för de två metoderna erhölls efter 24, 48 och 72 h inkubation vid 37ºC, och CNS-arter identifierades enligt det identifieringssystem som föreslogs i figuren.,
statistisk analys – för att bestämma graden av överenskommelse mellan de metoder som används för identifiering av CNS (förenklad metod, diskmetod och API Staph) och referensmetoden (Kloos& Schleifer 1975, Bannerman 2003) bedömdes testernas känslighet och specificitet (Sox 1986) enligt följande.,
känslighet: andel av CNS-stammar som testades positivt för en viss art med referensmetoden och som identifierades som samma art med den analyserade metoden (förenklad metod, disk eller API Staph).
specificitet: andel av CNS-stammar som testades negativt för en viss art med referensmetoden och som också var negativa för samma art när de testades med den analyserade metoden (förenklad metod, disk eller API Staph).
resultat
de 100 stafylokockisolaten testades med de fyra föreslagna metoderna., De resultat som erhölls med referensmetoden (Kloos & Schleifer 1975, Bannerman 2003) jämfördes med dem som erhölls med de modifierade metoderna och API Staph-systemet.
tabell III visar identifieringsavtalet mellan de analyserade analyserna och referensmetoden. Den förenklade metoden och diskmetoden visade 100 och 99% positivitet jämfört med referensmetoden, medan denna procentandel var 84% för API Staph-systemet. Av de 16 isolaten med oenighet om identifiering med API Staph-metoden, 10 (62.,5%) visade korrekt identifiering men med en % ID på 7,1 till 31%, lägre än det acceptabla värdet.
den förenklade metoden som genomfördes i två steg skilde sig inte från referensmetoden när det gäller identifiering av CNS-arter. I motsats till de andra metoderna visade diskmetoden felaktig identifiering och felaktigt identifierade en S. hominis-stam (6,5%) på grund av att sackaros inte jästes på skivan, vilket ledde till klassificeringen av denna stam som S. caprae. Ingen inkongruens observerades för de andra arterna.,
Den största skillnad observerades mellan referensmetoden och API Staph systemet, med den senare metoden inte kan identifiera 1 S. epidermidis stam (dessa identifieras som S. lugdunensis), 3 S. haemolyticus stammar (2 identifierats som S. aureus och 1 som S. hominis), 4 S. hominis stammar (2 identifierats som S. lugdunensis, 1 S. haemolyticus och 1 som S. aureus), och 8 S. warneri stam (3 identifierats som S. lugdunensis, 2 S. haemolyticus, 2 S. hominis och 1 som S. saprophyticus) (Tabell III).,
diskussion
CNS är de mikroorganismer som oftast isoleras från blododlingar, som representerar ett allvarligt hälsoproblem i många utvecklingsländer och även utvecklats (Renneberg et al. 1995). Vissa studier har föreslagit ett samband mellan S. epidermidis och vårdrelaterade infektioner (Vuong & Otto 2002) med denna arter som identifierats i 74 och 92% av patienterna med bacteremias som orsakas av CNS (Martin et al. 1989). Andra studier har dock rapporterat en rad infektioner orsakade av andra CNS-arter (Herwaldt et al. 1996), huvudsakligen S., haemolyticus, som är den näst vanligaste arten (Bannerman 2003). Eftersom CNS är etiologiska medel för en serie av infektiösa processer, identifiering av dessa mikroorganismer är viktigt för bestämning av deras fysiopatologiska egenskaper och klinisk betydelse och för epidemiologiska studier, och har lett till publiceringen av olika studier analysera identifieringsmetoder för dessa bakterier (Knapp & Washington 1989, Bannerman et al. 1993, Piccolomini m.fl. 1994, Renneberg m.fl. 1995, Ieven 1995, de Paulis m.fl. 2003).,
i denna studie gav de metoder som modifierats i vårt laboratorium goda resultat när det gäller korrekt klassificering av CNS-arter jämfört med referensmetoden, med 100% överenskommelse som observeras för den förenklade modifierade metoden och 99% överenskommelse om diskmetoden.
den förenklade metoden med hjälp av identifierings sche-me som föreslås här (figur) ledde till identifiering av S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus, S. capitis och S. simulans i ett enda steg, med totalt sju biokemiska tester, ett tal lägre än det som användes i referensmetoden (16 test)., Eftersom S. epidermidis är den vanligaste isolerade arten, kan 70 till 90% av stammarna (Bannerman 2003) isolerade i det kliniska laboratoriet identifieras med ett minskat antal test.
med avseende på inkubationstid visade resultaten att 91% av de stammar som analyserades i studien fermenterade artspecifikt socker inom 48 h av inkubation vid 37ºC., De andra stammarna (9%) testade positiva för jäsning av givna sockerarter efter 72 h inkubation, vilket visar vikten av en inkubation av sockerfermentationstesterna på minst 72 h för att korrekt identifiera dessa mikroorganismer.
identifiering av S. cohnii, S. schleiferi underarter schleiferi, S. drog, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophyticus, och S. lugdunensis som krävs för verkställigheten av två eller tre ytterligare biokemiska tester, som avses enligt det andra steget, vilket varierade enligt de resultat som erhållits i det första steget av förenklad metod., 20 (37,7%) stammar som krävde det andra steget för deras identifiering fermenterad trehalos inom 24 h, vilket möjliggör tidigare fortsättning av de ytterligare testerna. En längre tid behövdes för att identifiera S. cohnii, S. schleiferi underarter schleiferi och S. caprae, eftersom det andra steget som krävs för identifiering av dessa arter inkluderade nitratreduceringstestet vars resultat endast är tillgängligt efter 48 h. detta faktum leder emellertid inte till en försening i diagnosen CNS eftersom frekvensen av dessa arter i kliniska prover är låg.,
diskmetoden visade sig också vara mycket effektiv och praktisk eftersom den inte kräver tidigare beredning av sockerarter, vilket förhindrar förlust av odlingsmedier, förutom att nå en hög överenskommelse i identifieringen av CNS med referensmetoden.
det kommersiella API Staph-paketet visade den lägsta noggrannheten i identifieringen av CNS bland de studerade metoderna (84% – avtalet), i samförstånd med studierna av (Bannerman et al. 1993, Renneberg m.fl. 1995).
S. warneri och S. hominis var de svåraste arterna att identifiera. Bannerman et al., (1993) rapporterade också en lägre noggrannhet vid identifieringen av dessa arter. I studien av Ieven et al. (1995) S. hominis identifierades med minsta noggrannhet av API ID 32 Staph-systemet. Detta fynd kan förklaras av bristen på kompletterande tester som novobiocinresistens, anaerob tillväxt i tioglykolat och hemolysinproduktion.
För S., haemolyticus, felaktig identifiering av API Staph system kan förklaras av det faktum att satsen inte föreslå hemolysin produktion som ett kompletterande test som skulle vara avgörande för identifiering av S. haemolyticus stammar.
tre (3%) av de 100 stammar som analyserades av API Staph-systemet identifierades som S. aureus, ett faktum som också rapporterades av Renneberg et al. (1995). Satsen befanns vara ineffektiv i dessa fall eftersom den inte begärde resultatet av det grundläggande och mest accepterade testet för identifiering av S. aureus, dvs,, koagulastestet (Koneman et al. 1997).
Enligt Piccolomini et al. (1994) det låga avtalet mellan API Staph och det traditionella biokemiska testet för identifiering av CNS kan förklaras av användningen av olika inkubationstider, substratkoncentrationer och/eller känslighetsmarkörer.,
Sammanfattningsvis befanns de två metoder som modifierats i vårt laboratorium vara mycket effektiva för rutinanvändning på grund av deras höga känslighet och specificitet jämfört med referensmetoden, förutom att kräva färre tester och därmed vara mer ekonomiska och snabbare än standardmetoden. Trots att det krävdes en kortare inkubationstid (18 h) visade API Staph-systemet en lägre känslighet vid identifieringen av vissa arter., Utan tvekan kommer CNS-artidentifiering att underlättas och uppmuntras av tillgången till ett enkelt, billigt och korrekt förfarande, särskilt på platser med begränsade resurser.
bekräftelser
till bioMérieux för donation av API Staph kit som används i denna studie.
Baker js 1984. Jämförelse av olika metoder för differentiering av stafylokocker och mikrokocker. J Clin Microbiol 19: 875-879.
Bannerman TL 2003. Staphylococcus, Micrococcus och andra katalas-positiva kocker som växer aerobt., I PR Murray, EJ Baron, Jorgensen JH, Pfaller MA, RH Yolken (red.), Handbok för Klinisk Mikrobiologi, American Society Microbiology, Washington, s. 384-404.
Bannerman TL, Kleemann KT, Kloos VI 1993. Utvärdering av Vitek Systems grampositiva identifikationskort för Art identifiering av koagulasnegativa stafylokocker. J Clin Microbiol 31: 1322-1325.
De Paulis EN, Predari S, Chazarreta CD, Santoianni JE 2003. Fem-test enkelt system för artnivå identifiering av kliniskt signifikant koagulasnegativa stafylokocker. J Clin Microbiol 41: 1219-1224.,
Bidraget CE, Sewell DL, Pfaller M, Bumgardner HUSVAGNAR, Willians JA 1994. Utvärdering av två kommersiella system för identifiering av koagulasnegativa stafylokocker till artnivå. Diag Microbiol Infect Dis 18: 1-5.
Herwaldt LA, Geiss M, Kao C, Pfaller M 1996. Det positiva värdet av att isolera koagulasnegativa stafylokocker från blododlingar. Clin Infect Dis 22: 14-20.
Hübner J, Goldmann DA 1999. Koagulasnegativa stafylokocker: roll som patogener. Annu Rev Med 50: 223-236.
Ieven M, Verhoeven J, Pattyn SR, Goossens H 1995., Snabb och ekonomisk metod för artidentifiering av kliniskt signifikanta koagulasnegativa stafylokocker. J Clin Microbiol 33: 1060-1063.
Kloos VI, Bannerman TL 1994. Uppdatering av klinisk betydelse av koagulasnegativa stafylokocker. Clin Microbiol Rev 7: 117-140.
Kloos VI, Schleifer KH 1975. Förenklat system för rutinmässig identifiering av humana Stafylokockarter. J Clin Microbiol 1: 82-88.
Knapp CC, Washington ja 1989., Utvärdering av trehalos-mannitolbuljong för differentiering av Staphylococcus epidermidis från andra koagulasnegativa stafylokockarter. J Clin Microbiol 27: 2624-2626.
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC 1997. Färg Atlas och lärobok av diagnostisk mikrobiologi, 5th ed., Lippincott, Philadelphia, 1395: – pp.
Kwok AYC, Chow AW 2003. Fylogenetisk studie av stafylokocker och Makrokockusarter baserade på partiella hsp60-gensekvenser. Int J Syst Evol Microbiol 53: 87-92.
Martin MA, pfaller MA, Wenzel Rp 1989., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia. Ann Intern Med 110: 9-16.
Osmon DR, Sampathkumar P, Cockerill FR 2000. Prosthetic joint infection due to Staphylococcus lugdunensis. Mayo Clinic Proceedings 75: 511-512.
Perl TM, Rhomberg PR, Bale MJ, Fuchs PC, Jones RN, Koontz FP, Pfaller MA 1994. Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diag Microbiol Infect Dis 18: 151-155.
Piccolomini R, Catamo G, Picciani C, D”Antonio D 1994., Utvärdering av Staph – System 18-R för identifiering av stafylokock kliniska isolat till artnivå. J Clin Microbiol 32: 649-653.
Renneberg J, Rieneck K, Gutschik E 1995. Utvärdering av Staph ID-system och Staph Zym system för identifiering av koagulasnegativa stafylokocker. J Clin Microbiol 33: 1150-1153.
Sox HC 1986. Sannolikhetsteori vid användning av diagnostiska tester. En introduktion till kritisk litteraturstudie. Ann Praktikant Med 104: 60-66.
Trülzsch K, Rinder H, Trèek J, Bader L, Wilhelm U, Heesemann J 2002., ”Staphylococcus pettenkoferi”, a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diag Microbiol Infect Dis 43: 175-182.
Vuong C, Otto M 2002. Staphylococcus epidermidis infections. Microb Infect 4: 481-489.