Räkna celler med en hemocytometer
Figur 1. Hemocytometer rutnät.
Hemocytometer diagram som anger en av de uppsättningar av 16 rutor som ska användas för räkning.
Webinar transcript
räkna celler möjliggör korrekt bestämning av cellnummer, och därför konsekvens mellan experiment. Denna video kommer att beskriva förfarandet för att räkna både suspension och vidhäftningsceller med hjälp av en hemocytometer.
innan arbetet påbörjas, spraya noggrant insidan av laminärflödessäkerhetsskåpet med desinfektionsmedel och torka av med vävnad., Kassera använd vävnad i lämplig avfallskorg. Därefter spraya insidan av huven med 70% etanol och torka av med vävnad. Huven är nu ren och klar att använda. Ta bort cellkulturmedier och trypsin från kylskåpet och placera i en fuktad, 37-graders C, koldioxidinkubator för att värma. Under tiden, titta på de celler som ska räknas med hjälp av ett mikroskop för att kontrollera eventuella visuella tecken på bakteriell och svampförorening. Spraya media flaskor och pipet med 70% etanol innan du spelar i laminär flödessäkerhet skåp.,
för suspensionsceller, skaka kolven försiktigt för att säkerställa att cellerna är väl blandade. Innan de får en chans att lösa sig, ta ett 0,5 milliliter prov av cellsuspension och pipet i ett sterilt Eppendorf-rör. För vidhäftningsceller, ta bort befintliga medier, tvätta med rumstemperatur PBS och tillsätt trypsin EDTA för att lossa cellerna. Se Tabell ett för de volymer av PBS och trypsin som krävs. Inkubera cellerna i två till fem minuter i den fuktade 37 grader c, koldioxid inkubator. Inkubationstiden måste optimeras för celltypen., När alla celler frigörs, neutralisera trypsin EDTA med varmt serum innehållande tillväxtmedium som är lämpligt för cellerna och kulturen. Se Tabell ett för de volymer som krävs.
suspendera cellerna genom att försiktigt piperera cellsuspensionen upp och ner tre gånger och överföra dem till ett 50 milliliterrör. Centrifugera cellsuspensionen i fem minuter vid 1 000 varv per minut vid rumstemperatur., Ta bort supernatanten med en steril serologisk pipet och suspendera cellpaletten med 37-graders C-serum innehållande tillväxtmedium till den ursprungliga volymen av startkulturen. Använd en fem milliliter steril pipet, ta och 0,5 milliliter prov av cellsuspension och överför till ett sterilt Eppendorf-rör.
för att räkna, förbered den disponibla hemocytometern. Använd en P2000 Gilson Pipet, ta 100 mikroliter suspension, och Lägg till 400 mikroliter trypan blå, notera,.08% och blanda väl., Ta 100 mikroliter av trypan blue cell suspension mix, och försiktigt pipetera en droppe av suspensionen i brunnen av räkningskammaren, vilket gör att kapillärverkan för att dra provet i. Var försiktig så att du inte överfyller räkningskammaren. Visa räkningsområdet under en 10 gånger förstoring med ett inverterat mikroskop. Med hjälp av mikroskopet, fokusera på ett av de fyra med fyra galler på hemocytometern och räkna cellerna med ett negativt för trypanblå. De här är livskraftiga. Notera också hur många celler som var positiva för trypanblå., Dessa celler är döda, och detta nummer kan användas senare för att beräkna Odlingens procentuella livskraft om det behövs.
vid räkning, använd ett system där celler endast räknas när de befinner sig inom en kvadrat, eller på höger eller nedre gränslinjen. Registrera antalet celler som räknas i denna uppsättning av 16 rutor och flytta hemocytometern tills alla fyra uppsättningar av 16 rutor på hemocytometern har räknats och deras värden registreras., För att beräkna cellkoncentrationen, ta det genomsnittliga antalet livskraftiga celler i de fyra uppsättningarna av 16 rutor och multiplicera med 10 000 för att få antalet celler per milliliter. Multiplicera sedan detta med fem för att korrigera för den i fem utspädning från trypan blue addition. Detta slutvärde är antalet livskraftiga celler per milliliter i den ursprungliga cellsuspensionen.,
till exempel, om ditt livskraftiga celltal är 200 000 celler per milliliter i en volym av 20 milliliter och du vill se 10 000 celler i den nya kolven, måste du överföra 50 mikroliter av din cellsuspension till den nya kolven. Överför den önskade volymen cellsuspension till den nya kolven. Fyll på med media och sätt i inkubatorn.