Cellen tellen met behulp van een hemocytometer
figuur 1. Hemocytometer rasterlijnen.
Hemocytometerdiagram dat een van de sets van 16 vierkanten aangeeft die gebruikt moeten worden voor het tellen.
webinar transcript
het tellen van cellen maakt de nauwkeurige bepaling van celaantallen mogelijk, en dus consistentie tussen experimenten. Deze video zal de procedure beschrijven voor het tellen van zowel suspensiecellen als therapiecellen met behulp van een hemocytometer.besproei vóór aanvang van de werkzaamheden de binnenkant van de laminaire flow veiligheidskast grondig met een desinfecterend middel en veeg met weefsel schoon., Gooi het gebruikte weefsel weg in de daarvoor bestemde afvalbak. Spuit vervolgens de binnenkant van de kap met 70% ethanol en veeg schoon met weefsel. De kap is nu schoon en klaar voor gebruik. Verwijder celkweekmedia en trypsine uit de koelkast en plaats in een bevochtigde, 37-graden C, koolstofdioxide incubator om op te warmen. Ondertussen, kijk naar de cellen die moeten worden geteld met behulp van een microscoop om te controleren op eventuele visuele tekenen van bacteriële en schimmelbesmetting. Spuit media flessen en pipet met 70% ethanol voor het spelen in de laminaire flow veiligheidskast.,
voor suspensiecellen de kolf voorzichtig schudden om ervoor te zorgen dat de cellen goed gemengd zijn. Voordat ze de kans krijgen om zich te vestigen, neem een 0,5 milliliter monster van celsuspensie en pipet in een steriele Eppendorf buis. Voor therapiecellen, verwijder bestaande media, was met kamertemperatuur PBS, en voeg trypsine EDTA om de cellen los te maken. Zie Tabel 1 voor de benodigde volumes PBS en trypsine. Incubeer de cellen gedurende twee tot vijf minuten in de bevochtigde 37 graden C, koolstofdioxide incubator. De incubatietijd zal moeten worden geoptimaliseerd voor het celtype., Wanneer alle cellen losgemaakt zijn, neutraliseert u de trypsine-EDTA met warm serum dat groeimedia bevat die geschikt zijn voor de cellen en de cultuur. Zie Tabel 1 voor de vereiste volumes.
resuspendeer de cellen door de celsuspensie voorzichtig driemaal op en neer te pipetteren en over te brengen in een tube van 50 ml. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 1000 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur., Verwijder het supernatant met een steriele serologische pipet en resuspendeer het celpalet met 37 graden C serum dat groeimedia bevat tot het oorspronkelijke volume van de startcultuur. Met behulp van een vijf milliliter steriele pipet, nemen en 0,5 milliliter monster van celsuspensie, en overdracht in een steriele Eppendorf buis.
maak de wegwerp hemocytometer klaar om te tellen. Gebruik een P2000 Gilson Pipet, neem 100 microliters suspensie, en voeg aan 400 microliters trypan blue, let op,.08% en meng goed., Neem 100 microliter van de trypan blue cell suspension mix, en Pipetteer voorzichtig een druppel van de suspensie in de put van de telkamer, zodat capillaire werking het monster binnen kan trekken. Zorg dat de telkamer niet overbelast wordt. Bekijk het telgebied onder een 10-voudige vergroting met een omgekeerde microscoop. Met behulp van de microscoop, focus op een van de vier bij vier roosters op de hemocytometer en tel de cellen op een negatief voor trypan blauw. Deze zijn levensvatbaar. Noteer ook hoeveel cellen positief waren voor trypan blue., Deze cellen zijn dood, en dit aantal kan later worden gebruikt om de procentuele levensvatbaarheid van de cultuur te berekenen indien nodig.
gebruik bij het tellen een systeem waarbij cellen alleen worden geteld als ze zich binnen een vierkant bevinden, of op de rechter-of onderste grenslijn. Noteer het aantal cellen geteld in deze set van 16 vierkantjes en verplaats de hemocytometer totdat alle vier sets van 16 vierkantjes op de hemocytometer zijn geteld en hun waarden zijn geregistreerd., Om de celconcentratie te berekenen, neem het gemiddelde aantal levensvatbare cellen in de vier reeksen van 16 vierkanten en vermenigvuldig met 10.000 om het aantal cellen per milliliter te krijgen. Vermenigvuldig dit vervolgens met vijf om te corrigeren voor de één in vijf verdunning van de trypan blue toevoeging. Deze uiteindelijke waarde is het aantal levensvatbare cellen per milliliter in de oorspronkelijke celsuspensie.,
als bijvoorbeeld het aantal levensvatbare cellen 200.000 cellen per milliliter in een volume van 20 milliliter is en u 10.000 cellen in de nieuwe kolf wilt zien, moet u 50 microliter van uw celsuspensie in de nieuwe kolf overbrengen. Breng de benodigde hoeveelheid celsuspensie over in de nieuwe kolf. Vul het aan met media en zet het in de incubator.