Anti-mitochondriální protilátky u systémového lupus erythematodes a jejich asociace s projevy onemocnění
schválení Studie
populace Pacientů
lidského séra testovaných v této studii byly získány z University Health Network výzkumu etickou komisi (REB) schválené studie SLE a APS pacientů v Torontu, stejně jako od zdravých kontrol a pacientů, PBC rekrutují z CHU de Québec – Université Laval REB schválené studie v Quebec City., Pacienti SLE museli splňovat klasifikační kritéria ACR z roku 1982 pro SLE revidovaná v roce 199781,82 a pacienti APS splnili kritéria Sapporo z roku 1999 pro APS revidovaná v roce 200683,84. Pro SLE byly mezi srpnem 2010 a říjnem 2011 osloveny po sobě jdoucí pacientky z kliniky Lupus University of Toronto (UTLC), aby byly součástí studie o úloze mastných kyselin a kardiovaskulárních chorob při lupusu. Poskytli jeden vzorek krve a měli své anonymizované klinické údaje spojené s jejich biospecimenem., Podobně byli osloveni pacienti APS pozorovaní na revmatologické klinice v Torontu po podobném postupu. Všechny zbývající biospecimen by mohly být použity pro budoucí studie biomarkerů lupusu podle souhlasu původních subjektů. Dobrovolníci zdravé kontroly byli přijati jako součást studie o markerech zánětu, pokud neměli žádné známé nemoci a neměli infekční příznaky v době odběru krve. Věk a pohlaví byly v té době shromážděny. Pacienti s PBC splnili klasifikační kritéria PBC z roku 2009, revidovaná v roce 201838,85, včetně pozitivity pro anti-mitochondriální protilátky.,
Údaje z klinických laboratoří
Pro SLE pacientů, anti-dsDNA byly měřeny pomocí Farr testu (laboratorní cut-off 30%) a anti-kardiolipin (IgG a IgM – laboratorní cut-off 40 GPL či MPL jednotek) byly měřeny pomocí ELISA v klinické laboratoři.
Buněčné kultury
Indukovatelné myší model SLE
Doporučení Kanadské Rady v Péči o zvířata byly sledovány v protokolu schválen dobrých životních podmínek Zvířat Výboru na Université Laval., C57BL/6 J byly získány z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) a sídlí v Elitní-Plus specific-pathogen-free zařízení pro zvířata na CHU de Quebec. SLE autoprotilátky byly indukovány u těchto myší, jak bylo dříve popsáno63. Ve zkratce, 6-8 týdnů staří samci myší obdržel 100 µL já.v. injekce ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA) a následně 24 h později 100 µL já.v. injekce lipopolysacharid (LPS z E. coli O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Tyto injekce byly opakovány po 2 a 4 týdny, celkem tři kola očkování a myši byly bled 48 h po třetím očkování. Jako ovládací prvky byly použity myši c57bl / 6 J injikované i.v. s PBS podle stejného plánu.
etika
během celé studie byly vzorky krve získány od pacientů s informovaným souhlasem. Všechny metody uvedené v této studii byly provedeny v souladu s příslušnými pokyny a předpisy pro dárce lidí i myší.,
izolace mitochondrií
mitochondrie byly izolovány z jater myší c57bl / 6 J po kombinaci publikovaných protokolů61, 62. Myši byly obětována cervikální dislokací, jater byl rychle odstraněn, žlučník pryč, a játra byly opláchnuty v ledovém PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Játra byla pak mleté a přeneseny do předem vychlazené sklenice/Teflon tkáně mlýnek obsahující 12 mL ledové mitochondriální izolačního pufru (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM sacharóza) na gram jater pak zem, dokud homogenní suspenze byl získán. Neporušené buňky a jádra byly peletovány dvakrát při 700 g, 4 °C, 10 min. Kontaminace membrány, proteiny a organely byly odstraněny dva centrifugations na 7000 g, 4 °C, 10 min, následuje centrifugace při 10000 g, 4 °C, 10 min., Hrubé mitochondriální suspenze byla dále čistí ultracentrifugation proti Percoll gradientu (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) na 95,000 g, 4 °C, 30 min. Skupina obsahující mitochondrie byla shromážděna v PBS. Podobný přístup byl použit k izolaci lidských mitochondrií s výjimkou toho, že až 107 buněk Hep-G2 bylo lyzováno opakovanými průchody úzkorozchodnou jehlou., Komerční soupravy QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Německo) byl také použit, následující pokyny výrobce, k izolaci mitochondrií z Hep-G2 buňky pro kvalitní srovnání metodou western blotting s výše uvedeného protokolu. Izolované mitochondrie byly dávkovány metodou bcinchoninové kyseliny (BCA) za použití BCA proteinového testu Kit (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Čerstvě izolované mitochondrie byly použity ve všech experimentech s výjimkou přípravků submitochondriálních částic, pro které byly peletované mitochondrie udržovány při -80 °C, dokud nebylo potřeba.,
Příprava Submitochondriálních částic (SMP)
SMP byla připravena tak, jak je popsáno jinde.60. Krátce byly zmrazené mitochondrie rozmrazeny při pokojové teplotě a zředěny na 10 mg mitochondriálních proteinů v 10 mM 4-morpholinepropanesulfonové kyselině (MOPS). Vzorky byly pak ozvučují pomocí Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) na 20% maximální výkon po dobu 20 sekund, pak držel na sůl-ledové vodní lázni po dobu 10 minut. Tento cyklus se opakoval devětkrát., Vzorky byly poté odstředěny na 16 000 g, 4 °C, 10 minut, aby se odstranily neporušené mitochondrie a další nežádoucí nečistoty. Supernatanty byly shromážděny v čerstvé zkumavce a jejich objemy se upravily na 2 mL v 10 mm MOPS. Vzorky pak byly ultracentrifugovány při 150 000 g, 4 °C po dobu 45 minut. Pelety SMP byly resuspendovány v SMP pufru (225 mm mannitol, 75 mM sacharóza, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) a dávkovány. SMP přípravky byly udržovány na -80 ° C, dokud nebylo potřeba.,
Červené krvinky mikročástic (RBCMP) příprava
Červené krvinky (RBC), byly izolovány z krve zdravých lidských dobrovolníků odstředěním na 282 g na 10 minut při RT. Platelet-rich plasma a buffy coat byly vyřazeny, a RBC zlomek držel. RBC byly počítány (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) a upravena na koncentraci 5 × 108 buněk/mL v Tyrode ‚ s buffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukóza, 10 mM HEPES, pH 7.4)., 109 buněk bylo poté zředěno ve 45 mL dvojitě destilované vody a inkubováno po dobu 5 minut. Tonicita pufru byla pak vyvážena přidáním 5 ml PBS 10X (filtrována přes membránu 0, 22-µm). Zbytek RBC byly odstraněny centrifugací při 1300 g po dobu 5 minut při RT a supernatant byl centrifugated při 18,000 g po dobu 90 minut při 18 °C. RBC mikročástice pelet byl pak suspendován v 500 µl PBS. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí testu BCA.,
Western blotting
Mitochondriální velikost měření dynamického rozptylu světla (DLS)
velikost izolovaných mitochondrií byla měřena pomocí DLS, pomocí Zetasizer Nano ZS zařízení (Malvern instruments, Malvern, UK) vybavené standardní 4 mW, 633 nm He-Ne laser jako zdroj světla, sada na detekci v úhlu 173°. Experimenty byly replikovány tři krát v 1 cm délky na jedno použití UV-Kyvety (Brand GMBH, Wertheim, Německo) obsahující 100 µL izolované mitochondrie myších zředěný v PBS na koncentraci 10 µg proteinů/µL., Tyto parametry byly vzaty v úvahu při měření velikosti mitochondriální: index lomu rozpouštědla: 1.330, viskozita vzorku: 0.8872 mPas, refrakční index proteinů: 1.45, teplota: 25 °C.
Elektronová mikroskopie
Mitochondrie (108) byly stanoveny v 3.5% akrolein po dobu 15 min při pokojové teplotě. Pevné vzorky byly dvakrát opláchnuty v PBS a poté vloženy do 4% agarózy. 50 µm sekce byly řezány pomocí vibratomu, po fixaci v 1% osmium tetroxidu po dobu 30 minut a vloženy do pryskyřice Durcupan., Sedmdesát nanometrů ultratenkých úseků bylo vizualizováno na 80 kV pomocí elektronového mikroskopu Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI, Hillsboro nebo USA).
Hodnocení mitochondriální spotřeby kyslíku
Mitochondrie byly resuspendovány v mitochondriální assay roztoku (MAS: 70 mM sacharóza, 220 mM manitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA a 0,2%(w/v) mastné kyseliny-volné BSA, pH 7.4 při 37 °C) a doplněna 10 mM pyruvát, 2 mM malát a 4 µM FCCP , pH 7.4. Ekvivalent 10 µg proteinů byl nasazen na deskách XF-96 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Desky pak byly odstředěny 2,000 g po dobu 20 min při teplotě 4 °C. Můžeme vizualizovat distribuci mitochondrií pod jasným poli mikroskopu, aby zajistily dodržování a homogenní rozdělení. Desky byly udržovány při teplotě 37 °C bez CO2 přibližně 40 minut před naložením. Spotřeba kyslíku (OCR) byla měřena v souladu s pokyny výrobce (Agilent/Seahorse Bioscience). Experimenty byly replikovány ve třech jamkách a zprůměrovány pro každý experimentální stav., Celkem 3 měření spotřeby kyslíku za každého stavu byly přibližně každých 6 minut za bazálních podmínek a po postupném přidání rotenonu (2 µM), sukcinát (10 mM), antimycin A (40 µM) a TMPD (N,N,N‘,N‘-tetramethyl-p-fenylendiamin)/Askorbátu (100 µM/10 mM). Sukcinát byl použit jako dárce elektronů pro komplex II, rotenon jako inhibitor komplexního i, antimycin a jako komplexní inhibitor III a dýchání komplexem IV bylo měřeno pomocí TMPD / askorbátu.,
Vysoká citlivost průtokové cytometrie
Vzhledem k jejich malé velikosti, mitochondrie byla zjištěna vysoká citlivost průtokové cytometrie, pomocí „malých částic možnost“, skládající se z forward scatter (FSC) spojený s elektronky fotonásobičů (PMT) namontované na BD FACS Canto II Zvláštní Objednávku Výzkum Produktu (chceš prodávat, BD Biosciences). Mitochondrie (0,5 µg) byly obarveny s 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (klon IC9-2, Sigma-Aldrich) a 1 µM mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) po dobu 30 minut při 37 °C a ředit PBS, aby výsledný objem 500 µl, než průtoková cytometrie analýzy., Pro kvantitativní měření počtu mitochondrií jsme použili polystyrenovou mikrosféru o průměru 3 µm (Polysciences, PA, USA). Ke každému vzorku bylo přidáno 80 000 mikrosfér a bylo získáno 500 mikrosfér. Částice oxidu křemičitého (Kisker Biotech, Steinfurt, Německo) byly použity k určení velikosti 100-1 000 nm.
Mitochondriální DNA extrakce pomocí alkalické lýze
Izolované mitochondrie byly peletovaného na 10 000 g, 4 °C, 10 min a resuspendovány v 0,8 mL mtDNA izolace vyrovnávací paměti pro každý 3 mg mitochondriální proteiny., Mitochondrie byly poté lyzovány V jednom svazku (v:v) mtDNA izolační pufr B (extemporánně připravený. 0,2 M NaOH, 1% SDS) po dobu 3 min. na ledě, za mírného míchání. suspenze mtDNA byly neutralizovány jedním objemem (v:v) izolačního pufru mtDNA C (1,32 m octanu draselného, pH 4,8 upraveného kyselinou octovou za studena) po dobu 5 minut. na ledě, za mírného míchání. Mitochondriální trosky byly peletovány centrifugací po dobu 10 minut při 14 000 g, RT. Supernatanty byly přeneseny do čerstvých zkumavek. mtDNA byla vysrážena přes noc při -20 °C S 0.,1 objem (v:v) octan draselný (zásobní roztok: 3 M octan sodný, pH upraveno na 5,2 ledovou kyselinou octovou) a 0,7 objem (v:v) absolutní isopropanolu. mtDNA byl pak peletovaného na 14 000 g, promyje třikrát s 1,5 mL 70% ethanolu a resuspendovány v resuspenzi DNA pufru (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0). Koncentrace mitochondriální DNA byla stanovena spektrofotometrií (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
izolace jader z myších hepatocytů
jádra byla izolována z jater myší pomocí publikovaných metod., Krátce, v průběhu izolace mitochondrií protokoly, zatímco supernatanty byly použity pro provedení izolace mitochondrií, pelety z prvních 700 g centrifugace byly resuspendovány v 10 mL ledového jádra izolace pufru (5 mM MgCl2, 10 mM Tris–HCl, 250 mM Sacharóza. pH 7.4) a rozemleté v předchlazené skleněné / teflonové tkáňové mlýně. Suspenze byla dále narušena tím, že tři průchody přes 25 G5/8 jehlu následovaný dvěma průchody přes 27 G ½ jehlu., Suspenze byla poté filtrována proti 40 µM nylonovému buněčnému sítku (Thermo Fisher Scientific) a centrifugována při 600 g, 4 °C, 10 min. Pelety byly resuspendovány ve 14 mL pufru a a centrifugovány při 600 g, 4 °C, 10 min. Pelety byly následně resuspendovány v 9 objemech izolačního pufru B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris– HCl, 2,0 M sacharózy. pH 7, 4) a odstředěné při 16 000 g, 4 °C, 30 min. Pelety byly resuspendovány ve 200 µL PBS a skladovány při -20 °C.,
Celých buněk a jadernou DNA, izolace
DNA buď 25 mg celých myších jater nebo 200 µL nebo izolovaná jádra byla extrahována pomocí QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen) podle pokynů od výrobce. Vzorky byly eluovány v pufru na resuspenzi DNA.,
Mitochondriální DNA a nukleární DNA obohacení pomocí qPCR
Třicet ng mitochondriální DNA jaderná DNA nebo stejné množství celkové DNA extrahované z celé myších jater pomocí výše uvedených protokolů, byly zesíleny v Rotor-Gene Q reálném čase qPCR cyklovač (QIAgen) podle standardních protokolů s SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) v 10 µL reakční objem., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
Mitochondriální DNA trávení tím, restrikční enzymy
Čištěná myši mtDNA byl stráven Hae II nebo Pst jsem restriction endonucleases (NEB, Whitby, Kanada) podle výrobce je protokol. Štěpené produkty (1, 5 µg) byly poté vyřešeny na 0, 5% (w/v) agarózovém gelu. Snímky byly pořízeny na Dokumentačním systému Chemidoc MP gel (Bio-Rad). Celodenní gel je uveden v doplňkovém obr. 6d.,
S1 nuclease léčba mitochondriální DNA a nukleární DNA
30 µg mtDNA a nDNA jsou zředěné v 200 µL 1X S1-buffer a zacházet s 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 600 mM EDTA (konečná koncentrace) a inkubace při 70 °C po dobu 10 minut. Vzorky byly vysráženy přidáním 300 mm octanu sodného (konečná koncentrace) a 2 objemy (v:v) absolutního ethanolu po dobu 16 hodin při -20 °C., Vzorky byly peletovány na 14 000 g, RT, 20 minut a promyty 1 mL 70% ethanolu a resuspendovány v pufru pro resuspenzi DNA. Pro soutěžní testy následovaly neošetřené nDNA a mtDNA stejné ošetření bez přidání enzymu. Vzorky byly dávkovány qPCR.
Mitochondriích oxidace in-vitro
Dávkovat mitochondrie byly peletovaného a resuspendované v koncentraci 1,5 mg mitochondriálních proteinů/mL v PBS obsahující 500 µM z oxidant tertbutyl hydroperoxide (TBHP) (Sigma-Aldrich)., Mitochondrie byly oxidovány po dobu 1 hodiny 30 min při 37 ° C za mírného míchání a poté dvakrát opláchnuty ledově studenými PBS. Oxidované mitochondrie byly následně kvantifikovány BCA.
Mitochondriální oxidaci lipidů
Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) tvorba byla hodnocena pomocí TBARS Parametr Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) podle pokynů výrobce. Dvě stě mikrogramů mitochondrie byly roztrhli, proteiny byly vysráží pomocí kyseliny trichloroctové (TCA) a peletovaného 12 000 g, pokojová teplota, 4 min., Supernatanty byly přeneseny do čerstvých zkumavek. Vzorků (75 µL) byly inkubovány s 37.5 µL thiobarbituric acid v 96jamkovou destičku po dobu 3 h při 50 °C. Absorbances byly čteny při 532 nm na SpectraMax 190 mikrodestičky reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) a TBARS kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky za předpokladu, v soupravě. Oxidované vzorky byly porovnány s kontrolními mitochondriemi, které byly inkubovány za stejných podmínek v PBS bez TBHP.,
Mitochondriální oxidaci bílkovin
tvorba karbonylové skupiny po in-vitro mitochondriální oxidace byla měřena pomocí Protein Karbonyl Obsah Assay Kit (Sigma Aldrich) podle návodu výrobce. Oxidované vzorky byly porovnány s kontrolními mitochondriemi, které byly inkubovány za stejných podmínek v PBS bez TBHP.,
Detekce protilátek zaměřených mitochondriální epitopů pomocí ELISA
Pro detekci anti-celý mitochondriální protilátky (AwMA), myší mitochondrie byly naředěny (500 µg/mL) v 50 mM uhličitanu/bikarbonátovém pufru, pH 9.6. a 25 µL na jamku byly naloženy na 96-no half-oblast jasné, ploché dno polystyren high-závazné mikrotitrační destičky (Corning, New York, USA). Desky byly potaženy po dobu 18 h při 4 ° C a poté blokovány po dobu 4 h při 37 °C PBS obsahujícími 10% FBS a 0, 5% želatiny. Po třech promytí PBS se sera zředí 1: 150 (není-li uvedeno jinak) v PBS-10% FBS-0.,3% želatiny bylo inkubováno přes noc při 4 °C ve dvou vyhotoveních. Po třech promytí s PBS, destičky byly inkubovány 1 h při pokojové teplotě s alkalickou fosfatázou(AP) konjugované kozí anti-myší nebo anti-lidské IgG (Sigma-Aldrich) zředěného 1:1000 v PBS-0.4% bovinního sérového albuminu (BSA). Destičky byly promyty třikrát pomocí PBS a vyvinut s p-nitrofenol fosfát (p-NPP) pro ~30 min při 37 °C a optické hustoty (OD) byly čteny při 405 nm na mikrodestičky reader., Stejný protokol byl použit pro detekci autoprotilátek zaměřených submitochondrial částic pomocí 25 µL na jamku SMP zředěný (50 µg/mL) v 50 mM uhličitanu/bikarbonátovém pufru, pH 9.6. Podobný přístup byl použit pro lidská mitochondrie s následující úpravou: desky byly inkubovány s křenovou peroxidázou konjugované anti-lidské IgG sekundární protilátkou (1:3,000), peroxidázy byla odhalena při pokojové teplotě po dobu ~5 min s 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB). Reakce byla zastavena 2 N H2SO4 a ODs čtena na 450 nm., Pro anti-mtDNA ELISA byly desky předem potaženy 1% protaminsulfátem ve dvojitě destilované vodě po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Desky byly třikrát promyty PBS a potažené přes noc při 4 °C se 400 ng mtDNA v PBS. Všechny následující kroky byly totožné s kroky používanými pro AwMA-ELISAs. Prázdné hodnoty (mitochondriální antigeny A žádná séra) byly substragovány z naměřených hodnot pro každého pacienta. Během vývoje těchto testů byl správný povlak jamek testován pomocí monoklonálních protilátek myší odpovídajících isotypu (mAb). Monoklonální protilátka (klon IV.,3, 4 µg/mL) byl použit jako negativní test ovládání v každé instanci, zatímco různé monoklonální protilátky byly použity, v závislosti na povlaku antigeny, jako pozitivní test ovládání: anti-TOMM22 mAb (Klon IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) pro intaktní mitochondrie, anti-DNA mAb(klon 35I9 DNA, 10 µg / ml. Abcam) nebo anti-cytochrom C mAb(klon 7H8. 2C12, 5 µg / ml. Bd Biosciences).,
Soutěž, test
AwMA-testy Elisa byly provedeny, jak je popsáno v předchozích částech, s následujícími změnami: sérové vzorky byly preinkubovány v ředicím pufrem (1:150) s přídavkem různých koncentrací (0.25, 1 a 3 mg/mL) konkurentů (tj. mitochondrií nebo červených krvinek mikročástice) po dobu 3 hodin. na RT a inkubovány ve dvou vyhotoveních přes noc při 4 °C. Údaje jsou uvedeny jako procento signálu, zbývající po každé soutěži, ve srovnání se ABSORBANCE (405 nm) měřené v nepřítomnosti konkurentů.,
podobný postup byl použit pro AmtDNA-ELISA, pomocí zvýšené koncentrace (0, 3, 9 a 27 ng/µL) konkurenčních DNA (získané z jádra nebo mitochondrií, s nebo bez S1 nuclease léčby).
Statistiky
Srovnání mezi skupinami byly provedeny buď pomocí Student t-test, Wilcoxonův test, Friedman nebo Kruskal-Wallis testy, one-way ANOVA, two-way nebo opakovaná měření ANOVA v závislosti na výsledku, stejně jako počet a typ skupiny., Při více srovnání byly posouzeny příslušné post-hoc korekce testy byly použity jako Dunn, Dunnettův, Sidak, nebo s Bonferroniho korekcí. Asociace mezi AwMA, AmtDNA a anti-HSP60 byly vypočítány s Spearman korelace. Distribuce těchto protilátek podle výsledků ACA byla porovnána pomocí Wilcoxonova testu. Asociace mezi AwMA nebo AmtDNA a klinické výsledky byly studovány pomocí bivariační a multivariační lineární a logistické regrese., Klinické výsledky studovány jsou průměrné intima media thickness, procenta změna flow mediated dilatation (FMD) brachiální tepny, přítomnost SLINTAVKY a kulhavky, přítomnost plaku v krční, trombotické události někdy, bílých krvinek a trombocytů, zvýšená vazba na DNA tím, že Farr testu nad normální rozmezí pro zkušební laboratoř, přítomnost poškození podle SLICC Škody Index (SDI > 0), vysoká aktivita podle SLEDAI-2K skóre aktivity (SLEDAI ≥ 4), přítomnost lupus nefritida, biopsie třídy, stejně jako chronicity a index aktivity z biopsie., Ty byly upraveny pro trvání onemocnění, věk, index tělesné hmotnosti (BMI), lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL) cholesterol, antimalarické léky a prednison. Logistické regrese jsou prezentovány s lichými poměry a jejich 95% Wald interval spolehlivosti. Účastníků výsledky byly považovány za pozitivní pro AwMA a AmtDNA, když jejich hodnota byla nad cut-off hodnoty zjištěné po maximalizaci Youden Indexu. Interval spolehlivosti 95% byl získán pro cut-off pomocí vzorků bootstrap 10,000. Výkonnostní opatření jsou prezentována s jejich 95% přesným intervalem spolehlivosti.,
software
Western blot obrázky byly získány pomocí Image Studio číslic 5.2 (li-COR biotechnology). migrace mtDNA přes agarose gel byla zobrazena pomocí Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). Studie DLS byly prováděny pomocí vestavěného softwaru Zetasizer 7.10 (Malvern Instruments). Em snímky byly získány pomocí softwaru pro snímání obrazu 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). Průtoková cytometrie byla provedena pomocí Bd FACSDiva™ 6.1.3 (Bd Biosciences). Výnosy z izolací DNA byly kvantifikovány pomocí ND-1000 3.8.,1 software (Thermo Fisher Scientific) a qPCR byly provedeny s RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Optické hustoty byly měřeny pomocí SoftMax pro 5.4.1 (molekulární zařízení). Údaje byly sestaveny s ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA)a Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Statistické analýzy byly prováděny pomocí softwaru Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) a SAS verze 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).