Anti-mitokondrioiden autovasta-aineiden systeeminen lupus erythematosus ja niiden yhdessä taudin ilmenemismuotoja
Tutkimus hyväksyminen
potilasryhmässä
ihmisen sera testattu tässä tutkimuksessa saatiin University Health Network tutkimuksen etiikka board (REB) hyväksytty tutkimus SLE ja APS-potilaiden Torontossa sekä terveistä valvontaa ja PBC-potilailla, palvelukseen CHU de Québec – Université Laval REB hyväksytty tutkimuksia Quebec City., SLE-potilailla oli tavata 1982 ACR luokitus-kriteerit SLE uudistettu 199781,82 ja APS-potilaiden tavannut 1999 Sapporo kriteerit APS uudistettu 200683,84. SLE, peräkkäistä naisten potilaat, University of Toronto Lupus Klinikka (UTLC) oli lähestynyt ja antanut suostumusta välillä elokuussa 2010 ja lokakuun 2011 osa tutkimuksen rooli rasvahapot ja sydän-ja verisuonitautien lupus. He toimittivat yhden verinäytteen ja heillä oli nimettömät kliiniset tiedot, jotka liittyivät heidän biospesimeeniinsä., Samoin Toronton reumatologisella klinikalla nähtyjä APS-potilaita lähestyttiin samankaltaisen toimenpiteen jälkeen. Kaikkia jäljellä olevia biospecimeniä voitaisiin käyttää lupuksen biomarkkereita koskeviin tuleviin tutkimuksiin alkuperäisten tutkittavien suostumuksen mukaisesti. Terve ohjaus vapaaehtoisia rekrytoitiin osana tutkimuksen markkereita tulehduksen, jos heillä ei ollut tiedossa sairauksia, ja ei ole tarttuva oireet aikaan veren piirtää. Ikää ja seksiä kerättiin tuolloin. PBC-potilaat täyttivät vuoden 2009 PBC-luokituskriteerit, joita tarkistettiin vuonna 201838,85, mukaan lukien positiivisuus mitokondrioiden vasta-aineille.,
Tietoja kliinisissä laboratorioissa
SLE-potilailla, anti-dsDNA mitattiin käyttäen Farr määritys (laboratorio-cut-off-30%) ja anti-cardiolipin (IgG-ja IgM – laboratorio cut-off 40 GPL-tai MPL-yksikköä) mitattiin ELISA kliinisessä laboratoriossa.
Cell culture
Indusoituva hiiri malli SLE
Suositukset Canadian Council on Animal Care seurasivat pöytäkirjan hyväksynyt Eläinten Hyvinvointia Komitea Université Laval., C57BL/6 J saatiin Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) ja sijaitsee Eliitti-Plus erityinen-taudinaiheuttaja-vapaa-eläinten laitokseen CHU de Quebec. Näillä hiirillä indusoitiin SLE-autovasta-aineita, kuten aiemmin kuvailtiin63. Lyhyesti, 6-8-viikon vanha uros hiiret saivat 100 µL minä.v. injektiot ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA) ja sen jälkeen 24 h myöhemmin 100 µL minä.v. injektio lipopolysakkaridi (LPS E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)., Nämä injektiot toistettiin 2 ja 4 viikon kuluttua yhteensä kolmen rokotuskierroksen ajan ja hiiristä vuoti verta 48 tuntia kolmannen rokotuskerran jälkeen. C57BL/6 J hiiret pistetään minä.v. PBS saman aikataulun käytettiin verrokkeina.
Etiikka
koko tutkimuksen ajan, verinäytteet saatiin potilaille, alle tietoon perustuva suostumus. Kaikki tässä tutkimuksessa esitetyt menetelmät on tehty sekä ihmisen että hiiren luovuttajia koskevien ohjeiden ja määräysten mukaisesti.,
mitokondrioiden eristäminen
mitokondrioita eristettiin c57bl / 6 J-hiirten maksoista julkaistujen protocols61,62: n yhdistelmän jälkeen. Hiiret olivat uhrataan kohdunkaulan sijoiltaan, maksa oli nopeasti poistettu, sappirakko poistettu, ja maksassa oli huuhdella jääkylmää PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Maksa oli sitten jauhelihaa ja siirretään ennalta jäähdytetty lasi/Teflon kudoksen mylly, joka sisältää 12 mL jääkylmää mitokondrioiden eristäminen puskuria (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM sakkaroosi) per gramma maksan sitten maahan, kunnes homogeeninen suspensio oli saatu. Ehjiä soluja ja ytimiä pelletoitiin kahdesti 700 g: n, 4 °C: n ja 10 min: n lämpötilassa. Kontaminoivien kalvoja, proteiineja ja soluelimiin eliminoitu kaksi centrifugations 7000 g, 4 °C, 10 min, jonka jälkeen sentrifugoimalla 10 000 g, 4 °C, 10 min., Raakaöljyn mitokondrioiden jousitus oli edelleen puhdistetaan ultrasentrifugointi vastaan Percoll kaltevuus (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) klo 95,000 g, 4 °C, 30 min. Mitokondrioita sisältävä kaista kerättiin PBS: ään. Samanlaista lähestymistapaa käytettiin eristää ihmisen mitokondriot lukuun ottamatta, että jopa 107 Hep-G2-solut oli hajotettu toistuvasti kohtia läpi kapea-neula., Kaupallinen kit, QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Saksa) oli myös käytetty, seuraavat valmistajan ohjeita, eristää mitokondriot Hep-G2-solujen laadun vertailu western blotting, jossa edellä mainitun pöytäkirjan. Eristetyt mitokondriot annosteltiin bicinchoninic acid (BCA) – menetelmällä käyttäen BCA Protein Assay Kit-menetelmää (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Juuri eristettyjä mitokondrioita käytettiin kaikissa kokeissa lukuun ottamatta submitochondrial hiukkasia valmistelut, jotka pelletoitiin mitokondriot säilytettiin -80 °C: ssa, kunnes sitä tarvitaan.,
Submitokondriohiukkasten (SMP) valmistus
SMP valmistettiin kuvatulla tavalla muualla60. Lyhyesti jäädytetyt mitokondriot sulatettiin huoneenlämmössä ja laimennettiin 10 mg: aan mitokondrioproteiineja 10 mM: n 4-Morfolinepropaanisulfonihapolla (MOPS). Sitten näytteet sonikoitiin käyttäen Fisher Sonic Dismembrator Malli 500 (Thermo Scientific) – 20% maksimiteho 20 sekuntia, sitten huusi suola-jää-vesihauteessa 10 minuuttia. Tämä sykli toistui yhdeksän kertaa., Sitten näytteet sentrifugoidaan 16000 g, 4 °C, 10 minuuttia, jotta hävitä ehjä mitokondrioita ja muita ei-toivottuja roskat. Supernatantit kerättiin tuoreessa putkessa ja niiden tilavuudet säädettiin 2 mL: aan 10 mM: n MOPPEINA. Tämän jälkeen näytteet ultrasentrifugoitiin 150 000 g: n lämpötilassa 4 °C: n lämpötilassa 45 minuutin ajan. Pelletoitiin SMP olivat sekoitettava uudelleen SMP-puskuri (225 mM mannitoli, 75 mM sakkaroosi, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7.4) ja annostellaan. SMP-valmisteita säilytettiin -80 °C: ssa tarpeen mukaan.,
punasoluja mikropartikkeleita (RBCMP) valmistelu
punasoluja (RBC) eristettiin verestä terveille vapaaehtoisille sentrifugoimalla 282 g 10 minuutin ajan RT: ssä. Platelet-rich plasma ja buffy coat-hylättiin, ja RBC murto piti. RBC laskettiin (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) ja säätää pitoisuus on 5 × 108 solua/mL Tyrode on buffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukoosi ja 10 mM HEPES, pH 7.4)., Tämän jälkeen laimennettiin 109 solua 45 mL: aan kaksinkertaista tislattua vettä ja inkuboitiin 5 minuutin ajan. Se tonicity puskuri oli niin tasapainoinen lisäämällä 5 ml PBS 10X (suodatetaan 0.22-µm kalvo). Jäännös RBC poistettiin sentrifugoimalla klo 1300 g 5 minuuttia RT ja supernatantti oli centrifugated klo 18,000 g 90 minuuttia 18 °C. RBC microparticle pelletti oli sitten keskeytetty 500 µl PBS: ää. Proteiinipitoisuus mitattiin BCA-määrityksellä.,
Western blotting
Mitokondrioiden koko mittauksen dynaaminen valonsironta (DLS)
koko eristettyjä mitokondrioita mitattiin DLS, käyttäen Zetasizer Nano ZS-laitteen (Malvern instruments, Malvern, iso-BRITANNIA) varustettu standardin 4 mW, 633 nm He-Ne laser valonlähteenä, asetettu havaitseminen kulma 173°. Kokeet toistettiin kolme kertaa 1 cm pituus kertakäyttöisiä UV-Kyvetit (Brand GMBH, wertheim am main, Saksa), joka sisältää 100 µL eristetty hiiren mitokondriot laimennettu PBS: ään, jonka pitoisuus on 10 µg proteiineja/µL., Seuraavat parametrit on otettava huomioon, kun mitataan koko mitokondrio: taittuminen indeksi liuotin: 1.330, viskositeetti näyte: 0.8872 mPas, taittuminen indeksi proteiineja: 1.45, lämpötila: 25 °C.
Electron microscopy
Mitokondriot (108) olivat kiinteä 3,5% akroleiini 15 min huoneenlämmössä. Kiinteät näytteet huuhdeltiin kahdesti PBS sitten upotettu 4% agaroosia. 50 µm: n pätkiä leikattiin vibratomilla, joka oli kiinnitetty 1% osmiumtetroksidiin 30 minuutin ajan ja upotettu Durcupan-hartsiin., Seitsemänkymmentä nanometrin ultrathin kohdat olivat visualisoidaan 80 kV käyttäen Tecnai G2 Henki BioTWIN (FEI, Hillsboro, OR, USA) transmission electron microscope.
Arviointi mitokondrioiden hapenkulutus
Mitokondriot olivat sekoitettava uudelleen vuonna mitokondrioiden määritys ratkaisu (MAS: 70 mM sakkaroosi, 220 mM mannitoli, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA ja 0,2%(w/v) rasvahappo-ilmainen BSA, pH 7.4 37 °C) ja täydennetty 10 mM pyruvaatiksi, 2 mM malate ja 4 µM FCCP , pH 7.4. XF-96-lautasille (Agilent, Santa Clara, CA, USA) siemennettiin 10 µg proteiineja., Levyt olivat sentrifugoidaan on 2 000 g, 20 min, 4 °C. Me visualisoidaan jakelu mitokondriot alla kirkas-alan mikroskoopin noudattamisen varmistamiseksi ja homogeeninen jakautuminen. Levyjä säilytettiin 37 °C: ssa ilman CO2: ta noin 40 minuuttia ennen lastausta. Hapenkulutusnopeudet (OCR) mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Agilent/Seahorse Bioscience). Kokeet toistettiin kolmessa kaivossa, ja niiden keskiarvo oli kussakin kokeellisessa tilassa., Yhteensä 3 hapenkulutuksen mittaukset kunkin kunto oli tehty noin joka 6 minuuttia alle pohjapinta ehtoja ja sen jälkeen juokseva lisäksi rotenonia (2 µM), succinate (10 mM), antimycin (40 µM) ja TMPD (N,N,N’,N’-tetrametyyli-p-fenyleenidiamiini)/Yhteys (100 µM/10 mM). Succinate käytettiin elektroni luovuttaja monimutkaisia II, rotenoni niin monimutkainen en estäjä, antimycin On niin monimutkainen III: n estäjä ja hengityksen kautta monimutkainen IV mitattiin käyttämällä TMPD/yhteys.,
Korkea herkkyys virtaussytometria
Koska niiden pieni koko, mitokondriot olivat havaita korkea herkkyys virtaussytometria, käyttäen ”pieni hiukkanen vaihtoehto”, joka koostuu eteenpäin scatter (FSC) kytketty / monistusvalokennoille (PMT) asennettu BD FACS Canto II tilauksesta Tutkimus-Tuote (SORP, BD Biosciences). Mitokondriot (0,5 µg) olivat värjätään 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (klooni IC9-2, Sigma-Aldrich) ja 1 µM mitotracker syvä punainen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 30 minuutin ajan 37 °C ja laimennettiin PBS lopullinen tilavuus 500 µl ennen virtaussytometria-analyysi., Mitokondrioiden määrän kvantitatiiviseen mittaamiseen käytettiin 3 µm halkaisijaltaan olevaa polystyreeniä (Polysciences, PA, USA). Jokaiseen näytteeseen lisättiin 80 000 mikropalloa ja hankittiin 500 mikropalloa. Piidioksidi hiukkasia (Kisker Biotech, Steinfurt, Saksa) käytettiin määrittämään 100-1,000 nm kokoluokka.
Mitokondrio-DNA: n uutto, jonka alkalinen hajoaminen
Eristettyjä mitokondrioita oli ampunut 10 000 g, 4 °C, 10 min ja uudelleen suspendoidun 0,8 mL mtDNA eristäminen puskuri varten joka 3 mg mitokondrioiden proteiineja., Mitokondriot olivat sitten lyzed yksi tilavuus (v:v) mtDNA eristäminen buffer B (ex tempore-valmis. 0,2 m NaOH, 1% SDS) 3 min. jäällä, lempeän kiihtyneenä. mtDNA keskeytykset olivat neutraloidaan yksi tilavuus (v:v) mtDNA eristäminen puskuri C (1.32 M kaliumasetaatti, pH 4.8 säätää jääkylmää etikkahappo) 5 min. jäällä, lempeän kiihtyneenä. Mitokondrioromua pelletoitiin sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 14 000 grammassa RT. Supernatantit siirrettiin tuoreisiin putkiin. mtDNA saostettiin yön yli -20 °C: ssa 0.,1 tilavuus (v:v) kaliumasetaatti (varastossa ratkaisu: 3 M natriumasetaatti, pH säätää 5.2 jääkylmällä etikkahappo) ja 0,7 tilavuus (v:v) absoluuttinen isopropanolia. mtDNA oli sitten ampunut tällä 14,000 g, pestään kolmesti 1,5 mL 70% etanolia ja sekoitettava uudelleen vuonna DNA: n sekoittamista puskuria (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0). Mitokondrion DNA-pitoisuus määritettiin spektrofotometrialla (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
Ytimet erillään hiiren maksasoluissa
Ytimet eristettiin hiiren maksa käyttämällä julkaistu methods86., Lyhyesti, aikana mitokondriot eristäminen protokollat, kun supernatantit olivat käytetään suorittamaan mitokondriot eristykset, pellettien ensin 700 g sentrifugointi olivat sekoitettava uudelleen 10 mL: ssa jääkylmää ytimet eristäminen buffer A (5 mM MgCl2, 10 mM Tris–HCl, 250 mM Sakkaroosi. pH 7.4) ja jauhetaan valmiiksi jäähdytetyssä lasi / Teflon-kudosmyllyssä. Jousitus oli edelleen repinyt kolme kohtia läpi 25 G5/8 neula seurasi kaksi kohtia läpi 27 G ½ neula., Suspensio suodatettiin sitten vastaan 40 µM nylon solun siivilä (Thermo Fisher Scientific) ja sentrifugoidaan 600 g, 4 °C, 10 min. Pelletit suspendoitiin uudelleen 14 mL puskurissa A ja sentrifugoitiin 600 g, 4 °C,10 min. Pelletit olivat sekoitettava uudelleen 9 volyymit jääkylmää ytimet eristäminen buffer B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris– HCl, 2,0 M sakkaroosi. pH 7.4) ja sentrifugoitu 16 000 g, 4 °C, 30 min. Pelletit suspendoitiin uudelleen 200 µL: aan PBS: ää ja säilytettiin -20 °C: ssa.,
Koko solun ja tuman DNA: han eristäminen
DNA: joko 25 mg koko hiiren maksan tai 200 µL tai eristetty ytimet uutettiin käyttämällä QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen), seuraavat valmistajan ohjeita. Näytteet eluoitiin DNA: n sekoittamispuskurissa.,
Mitokondrioiden DNA: n ja tuman DNA: han rikastusta, jonka qPCR
Kolmekymmentä nanogrammaa mitokondrio-DNA, ydin-DNA: ta tai sama määrä yhteensä DNA uutetaan koko hiiren maksan käyttäen edellä mainittuja protokollia, oli täydennetty vuonna Rotor-Gene Q-real time qPCR cycler (QIAgen) standardin protokollia, joilla SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) 10 µL reaktion tilavuus., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
Mitokondrio-DNA ruoansulatusta, joita rajoitus entsyymejä
Puhdistettu hiiren mtDNA oli pilkottu Hae II tai Pst-en restriktioentsyymien (NEB, Whitby, ON, Kanada) valmistajan mukaan on pöytäkirja. Tämän jälkeen sulatetut tuotteet (1,5 µg) hävitettiin 0,5%: n (w/v) agaroosigeelillä. Kuvat hankittiin Chemidoc MP gel documentation system (Bio-Rad) – dokumentaatiojärjestelmään. Kokopitkä geeli on esitetty täydentävä Kuva. 6 D.,
S1 nuclease hoito mitokondrioiden DNA: n ja tuman DNA: han
30 µg mtDNA ja nDNA olivat laimennettuna 200 µL 1X S1-puskuri ja käsitelty 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) – 5 minuuttia 37 °C. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 600 mM EDTA (lopullinen konsentraatio) ja inkuboinnin 70 °C: ssa 10 minuuttia. Näytteet saostetaan lisäämällä 300 mM natriumasetaatti (lopullinen konsentraatio) ja 2 osaa (v:v) absoluuttinen etanoli 16 tuntia -20 °C: ssa., Näytteitä pelletoitiin 14 000 g: n, RT: n, 20 minuutin kohdalla, ja ne pestiin 1 mL 70-prosenttisesti etanolia ja suspendoitiin uudelleen DNA: n sekoittamispuskuriin. Kilpailumäärityksissä hoitamaton nDNA ja mtDNA seurasivat samaa hoitoa ilman entsyymin lisäystä. Näytteet antoi qPCR.
Mitokondriot hapettumista in vitro
Annostellaan mitokondriot olivat pelletoidaan ja sekoitettava uudelleen pitoisuutena 1,5 mg mitokondrioiden proteiineja/mL PBS: llä, joka sisältää 500 µM hapettimen tertbutyl kumeenivetyperoksidi (TBHP) (Sigma-Aldrich)., Mitokondriot olivat hapettunut 1 h 30 min 37 °C: ssa alle lempeä agitaatio sitten huuhdellaan kaksi kertaa jääkylmällä PBS. Oksidoidut mitokondriot määritettiin myöhemmin BCA: n avulla.
Mitokondrioiden lipidien hapettumista
Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) muodostumista arvioitiin käyttäen TBARS Parametri Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA), seuraavat valmistajan ohjeita. Kaksisataa mikrogrammaa mitokondriot olivat lyysattiin, proteiinit saostetaan käyttäen trikloorietikkahappoa (TCA) ja pelletoitiin 12000 g, huoneenlämmössä, 4 min., Supernatantit siirrettiin tuoreisiin putkiin. Näytteet (75 µL) olivat inkuboitiin 37, 5 µL thiobarbituric acid vuonna 96-kuoppalevyn 3 h 50 °C. Absorbances luettiin 532 nm on SpectraMax 190 mikrolevyn lukulaite (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ja TBARS kvantifiointi suoritettiin käyttäen standardia käyrä annetaan pakki. Hapettunut näytteitä verrattiin ohjaus mitokondrioita, jotka olivat inkuboitiin samoin edellytyksin PBS vailla TBHP.,
Mitokondrioiden proteiinien hapettumista
muodostumista karbonyyli moieties seuraavat in-vitro-mitokondrioiden hapettumista mitattiin käyttämällä Proteiini Karbonyyli-Sisältöä Assay Kit (Sigma Aldrich), valmistajan ohjeiden mukaisesti. Hapettunut näytteitä verrattiin ohjaus mitokondrioita, jotka olivat inkuboitiin samoin edellytyksin PBS vailla TBHP.,
Havaitseminen vasta-aineita, jotka mitokondrioiden epitopes ELISA
havaitsemiseksi anti-koko mitokondrio vasta-aineet (AwMA), hiiren mitokondriot olivat laimennettu (500 µg/mL) 50 mM karbonaatti/bikarbonaatti-puskuri, pH 9,6 ja 25 µL per kaivo on lastattu 96-no puoli-alueen selkeä tasainen pohja polystyreeni korkea-sitova mikrotiitterilevyt (Corning, New York, USA). Levyt olivat päällystetty 18 h 4 °C: ssa sitten tukossa 4 h 37 °C: ssa PBS, jossa 10% FBS ja 0,5% liivate. Kolmen PBS-pesun jälkeen sera laimennetaan 1:150 (ellei toisin mainita) PBS-10% FBS-0: ssa.,3% gelatiinia inkuboitiin yhdessä yössä 4 °C: ssa kahtena kappaleena. Kolmen pesee PBS, levyt olivat inkuboitiin 1 h huoneenlämmössä, jossa alkalinen fosfataasi-(AP) konjugoitua vuohen anti-hiiri tai anti-humaani-IgG: n (Sigma-Aldrich) laimennettiin 1:1000 PBS-0.4% naudan seerumin albumiinia (BSA). Levyt pestiin kolmasti PBS: llä ja kehitetty p-nitrofenoli fosfaatti (p-NPP) ja ~30 min 37 °C ja optisen tiheyden (OD) olivat levyt luetaan aallonpituudella 405 nm on mikrolevyn lukulaite., Samaa protokollaa käytettiin havaitsemiseksi autovasta kohdistaminen submitochondrial hiukkasia käyttämällä 25 µL per kaivo SMP laimennettu (50 µg/mL) 50 mM karbonaatti/bikarbonaatti-puskuri, pH 9.6. Samanlaista lähestymistapaa käytettiin ihmisen mitokondriot kanssa seuraavat muutokset: levyt olivat inkuboitiin kanssa piparjuuri peroksidaasi-konjugoitu anti-human IgG sekundaarinen vasta-aine (1:3000 dollari), peroksidaasi toiminta oli paljasti huoneenlämmössä ~5 min 3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiini (TMB). Reaktio lopetettiin 2 N H2SO4: llä ja ODs: n lukema oli 450 nm., Anti-mtDNA ELISA, levyt olivat pre-päällystetty 1% protamiinisulfaatin double-tislattua vettä, 1 h huoneenlämmössä. Levyt pestiin kolme kertaa PBS: llä ja päällystetty yön yli 4 °C 400 ng mtDNA PBS: llä. Kaikki myöhemmät vaiheet olivat samat kuin AwMA-Elisassa. Tyhjät arvot (mitokondrioantigeenit ja seerumit) olivat kunkin potilaan mitattujen arvojen substraatteja. Näiden määritysten kehittämisen aikana kaivojen asianmukainen päällystäminen testattiin käyttämällä isotyypin mukaisia hiiren monoklonaalisia vasta-aineita (mAb). Monoklonaalinen vasta-aine (klooni IV.,3, 4 µg/mL) käytettiin negatiivinen määritys ohjaus kussakin tapauksessa, kun eri monoklonaalisia vasta-aineita käytetään, riippuen pinnoitteen antigeenit, kuten positiivinen assay controls: anti-TOMM22 mAb (Klooni IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) ehjä mitokondrioita, anti-DNA-mAb (Klooni 35I9 DNA, 10 µg/mL. Abcam) tai anti-Sytokromi C mAb (Klooni 7H8.2C12, 5 µg/mL. BD biotieteet).,
Kilpailun pitoisuus
AwMA-ELISAs tehtiin kuten edellisissä luvuissa on kuvailtu seuraavin muutoksin: seeruminäytteet olivat esi-inkuboidaan laimennuspuskuria (1:150), joihin oli lisätty eri pitoisuuksia (0.25, 1 ja 3 mg/mL) kilpailijat (eli mitokondrioita tai punasoluja mikropartikkeleita) 3 tuntia. tällä RT ja inkuboitiin kahtena yön yli 4 °C: Tiedot esitetään prosenttiosuutena signaalin jäljellä sen jälkeen, kun kunkin kilpailun, verrattuna OD (405 nm) mitattuna ilman kilpailijoita.,
samanlaista menettelyä käytettiin AmtDNA-ELISA käyttäen lisääntynyt pitoisuudet (0, 3, 9 ja 27 ng/µL) kilpailevat (DNA uutetaan ytimiä tai mitokondrioita, kanssa tai ilman S1 nuclease hoito).
Tilastot
Vertailut ryhmien välillä tehtiin käyttäen joko studentin t-testi, Wilcoxonin testi, Friedman tai Kruskal-Wallis-testit, yksisuuntainen ANOVA, kaksi-tavalla tai toistettujen mittausten ANOVA tuloksista riippuen, sekä määrä ja tyyppi ryhmiin., Kun useita vertailuja arvioitiin, asianmukaiset post-hoc-korjaus testejä käytettiin, kuten Dunn ’ s, Dunnettin, Sidak tai Bonferroni on. Yhdistysten välillä AwMA, AmtDNA ja anti-HSP60 laskettiin kanssa Spearmanin korrelaatiot. Näiden vasta-aineiden jakautumista ACA-tulosten mukaan verrattiin Wilcoxon-testillä. Yhdistysten välillä AwMA tai AmtDNA ja kliinisiä tuloksia tutkittiin bivariate ja monimuuttuja lineaarinen ja logistinen taantumat., Kliinisiä tuloksia on tutkittu keskimääräinen intima media paksuus, prosenttia muutos virtaus välittämä dilatation (FMD) olkavarren valtimon, läsnäolo SUU-ja sorkkatauti, läsnäolo plakin kaulavaltimon, tromboottinen tapahtuma koskaan, veren valkosolujen määrä, verihiutaleiden määrä, lisääntynyt DNA: ta sitova Farr pitoisuus yli normaalin vaihteluvälin testauslaboratorio, läsnäolo vahingon mukaan SLICC Vahinkoa Indeksi (SDI > 0), korkea aktiivisuus mukaan SLEDAI-2K activity score (SLEDAI ≥ 4), läsnäolo lupus nefriitti, biopsia luokan, sekä kroonisuusaste ja aktiivisuus indeksi koepala., Jälkimmäisiä säädettiin sairauden keston, iän, painoindeksin (BMI), alhaisen tiheyden lipoproteiinien (LDL) kolesterolin, malarialääkkeiden ja prednisonin mukaan. Logistiset regressiot esitetään parittomilla suhdeluvuilla ja niiden 95%: n Wald-luottamusvälillä. Osallistujien tuloksia pidettiin Awman ja Amtdnan kannalta positiivisina, kun niiden arvo ylitti youdenin indeksin maksimoinnin jälkeen määritetyn raja-arvon. Katkaisuun saatiin 95 prosentin luottamusväli 10 000 bootstrap-näytteellä. Suoritustason mittarit esitetään niiden 95%: n tarkalla luottamusvälillä.,
ohjelmisto
Western blot images hankittiin Image Studio-numeroilla 5.2 (LI-COR biotechnology). mtDNA migration kautta agarose geeli imaged Käyttäen Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). DLS-tutkimuksia tehtiin sisäänrakennetulla Zetasizer 7.10-ohjelmistolla (Malvern Instruments). EM-kuvat hankittiin Kuvankaappausohjelmistolla 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). Virtaussytometria suoritettiin BD FACSDiva™ 6.1.3-menetelmällä (BD Biosciences). DNA-isolaatioiden tuotot määritettiin ND-1000 3.8: n avulla.,1 ohjelmisto (Thermo Fisher Scientific) ja qPCR tehtiin RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Optiset tiheydet mitattiin SoftMax Pro 5.4.1: llä (Molekyylilaitteet). Luvut olivat koottu ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) ja Photoshop CS6-13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, Yhdysvallat). Tilastollisia analyysejä tehtiin Prism 7-ohjelmistolla (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) ja SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).