autoanticorps anti-mitochondriaux dans le lupus érythémateux disséminé et leur association avec les manifestations de la maladie
approbation de L’étude
population de patients
les sérums humains testés dans cette étude ont été obtenus à partir d’une étude approuvée par le Comité D’éthique de la recherche (CER) du Réseau universitaire de santé chez des patients atteints de LED et de spa à Toronto, ainsi que chez des témoins sains et des patients atteints de CLC recrutés au CHU de Québec – Université Laval études approuvées par le CER à Québec., Les patients atteints de LED devaient satisfaire aux critères de classification ACR de 1982 pour les LED révisés en 199781,82 et les patients APS satisfaisaient aux critères de Sapporo de 1999 pour les APS révisés en 200683,84. Pour les LED, des patientes consécutives de la clinique du Lupus de L’Université de Toronto (UTLC) ont été approchées et ont donné leur consentement entre août 2010 et octobre 2011 pour participer à une étude sur le rôle des acides gras et des maladies cardiovasculaires dans le lupus. Ils ont fourni un échantillon de sang et leurs données cliniques anonymisées ont été liées à leur biospecimen., De même, les patients APS vus à la clinique de rhumatologie de Toronto ont été approchés à la suite d’une procédure similaire. Tous les biospecimen restants pourraient être utilisés pour de futures études sur les biomarqueurs du lupus selon le consentement des sujets originaux. Des volontaires témoins sains ont été recrutés dans le cadre de l’étude sur les marqueurs de l’inflammation s’ils n’avaient pas de maladies connues et ne présentaient pas de symptômes infectieux au moment du prélèvement sanguin. L’âge et le sexe ont été recueillis à ce moment-là. Les patients atteints de CBP répondaient aux critères de classification du CBP de 2009, révisés en 201838,85, y compris la positivité des anticorps anti-mitochondriaux.,
données des laboratoires cliniques
pour les patients atteints de LED, les anti-adndd ont été mesurés à L’aide du test Farr (seuil de laboratoire de 30%) et les anti-cardiolipines (seuils IgG et IgM-Laboratoire de 40 unités GPL ou MPL) ont été mesurés par ELISA dans un laboratoire clinique.
culture cellulaire
modèle murin inductible de led
Les recommandations du Conseil canadien de protection des animaux ont été suivies dans un protocole approuvé par le Comité du bien-être Animal de l’Université Laval., Les C57BL / 6 J ont été obtenus des laboratoires Jackson (Bar Harbor, ME, États-Unis) et logés dans une installation pour animaux sans pathogène spécifique Elite-Plus au CHU de Québec. Des autoanticorps du LED ont été induits chez ces souris comme décrit antérieurement63. En bref, des souris mâles âgées de 6 à 8 semaines ont reçu des injections I. V. de 100 µL de ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA) suivies 24 h plus tard d’une injection i. v. de lipopolysaccharide de 100 µL (LPS d’E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Ces injections ont été répétées après 2 et 4 semaines pour un total de trois séries de vaccinations et les souris ont été saignées 48 h après la troisième vaccination. Des souris C57BL / 6 J injectées par voie intraveineuse de PBS selon le même schéma ont été utilisées comme témoins.
éthique
tout au long de l’étude, des échantillons de sang ont été prélevés sur des patients sous consentement éclairé. Toutes les méthodes présentées dans cette étude ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes pour les donneurs humains et murins.,
isolement des mitochondries
des mitochondries ont été isolées du foie de souris C57BL / 6 J à la suite d’une combinaison de protocoles publiés61,62. Des souris ont été sacrifiées par luxation cervicale, le foie a été rapidement enlevé, la vésicule biliaire excisée et le foie a été rincé dans du PBS glacé (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Le foie a ensuite été émincé et transféré dans un broyeur de tissu en verre/téflon pré-refroidi contenant 12 mL de tampon d’isolement mitochondrial glacé (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM saccharose) par gramme de foie, puis broyé jusqu’à l’obtention d’une suspension homogène. Les cellules et les noyaux intacts ont été granulés deux fois à 700 g, 4 °C, 10 min. Les membranes contaminantes, les protéines et les organites ont été éliminés par deux centrifugations à 7 000 g, 4 °C, 10 min suivies d’une centrifugation à 10 000 g, 4 °C, 10 min., La suspension mitochondriale brute a ensuite été purifiée par ultracentrifugation contre un gradient de Percoll (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% V:V Percoll) à 95 000 g, 4 °C, 30 min. La bande contenant les mitochondries a été collectée dans le PBS. Une approche similaire a été utilisée pour isoler les mitochondries humaines, à l’exception que jusqu’à 107 cellules Hep-G2 ont été lysées par des passages répétés à travers une aiguille de calibre étroit., Le kit commercial QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Allemagne) a également été utilisé, suivant les instructions du fabricant, pour isoler les mitochondries des cellules Hep-G2 pour une comparaison de qualité par Western blotting avec le protocole susmentionné. Des mitochondries isolées ont été dosées par la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA) en utilisant le kit de dosage de la protéine BCA (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Des mitochondries fraîchement isolées ont été utilisées dans toutes les expériences, à l’exception des préparations de particules submitochondriales pour lesquelles des mitochondries granulées ont été maintenues à -80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.,
préparation de particules Submitochondriales (SMP)
Les SMP ont été préparées comme décrit ailleurs 60. Brièvement, les mitochondries congelées ont été décongelées à température ambiante et diluées à 10 mg de protéines mitochondriales dans 10 mm d’acide 4-Morpholinépropanesulfonique (MOPS). Les échantillons ont ensuite été soniqués à l’aide d’un Dismembrateur Fisher Sonic Modèle 500 (Thermo Scientific) à 20% de sortie maximale pendant 20 secondes, puis conservés au bain-marie sel-glace pendant 10 minutes. Ce cycle a été répété neuf fois., Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 16 000 g, 4 °C, 10 minutes afin de jeter les mitochondries ininterrompues et autres débris indésirables. Les surnageants ont été recueillis dans un tube frais et leurs volumes ajustés à 2 mL dans des vadrouilles de 10 mM. Les échantillons ont ensuite été ultracentrifugés à 150 000 g, 4 °C pendant 45 minutes. On a remis en suspension les PSM granulés dans un tampon PSM (225 mm de mannitol, 75 mM de saccharose, 10 mM D’HEPES, 0,1 mM D’EDTA, pH 7,4) et on les a dosés. Les préparations SMP ont été conservées à -80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.,
préparation de microparticules de globules rouges (RBCMP)
Les globules rouges (RBC) ont été isolés du sang de volontaires humains sains par centrifugation à 282 g pendant 10 minutes à RT. le plasma riche en plaquettes et la couche buffy ont été jetés et la fraction RBC conservée. RBC ont été comptés (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) et ajustés à une concentration de 5 × 108 cellules/mL dans le tampon de Tyrode (12 mm NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4)., 109 cellules ont ensuite été diluées dans 45 mL d’eau double distillée et incubées pendant 5 minutes. La tonicité du tampon a ensuite été équilibrée par addition de 5 ml de PBS 10X (filtré à travers une membrane de 0,22 µm). Les restes de RBC ont été éliminés par centrifugation à 1 300 g pendant 5 minutes à RT et le surnageant a été centrifugé à 18 000 g pendant 90 minutes à 18 °C. La pastille de microparticules de RBC a ensuite été mise en suspension dans 500 µl de PBS. La concentration en protéines a été mesurée avec l’analyse BCA.,
Western blot
mesure de la taille des mitochondries par diffusion dynamique de la lumière (DLS)
la taille des mitochondries isolées a été mesurée par DLS, en utilisant un dispositif Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments, Malvern, UK) équipé du laser He-Ne standard de 4 mW, 633 nm comme source lumineuse, réglé à un angle de détection de 173°. Des expériences ont été répliquées trois fois dans des Cuvettes UV jetables de 1 cm de longueur (Brand GMBH, Wertheim, Allemagne) contenant 100 µL de mitochondries murines isolées diluées dans du PBS à une concentration de 10 µg de protéines/µL., Les paramètres suivants ont été pris en compte lors de la mesure de la taille de la mitochondrie: indice de réfraction du solvant: 1,330, viscosité de l’échantillon: 0,8872 mPas, indice de réfraction des protéines: 1,45, température: 25 °c.
microscopie électronique
les mitochondries (108) ont été fixées dans 3,5% d’acroléine pendant 15 min à température ambiante. Les échantillons fixes ont été rincés deux fois dans du PBS puis incorporés dans de l’agarose à 4%. Des sections de 50 µm ont été découpées à l’aide d’un vibratome, post-fixées dans du tétroxyde d’osmium à 1% pendant 30 minutes et incorporées dans de la résine Durcupane., Des sections ultraminces de soixante-dix nanomètres ont été visualisées à 80 kV à l’aide d’un microscope électronique à transmission Tecnai G2 Spirit BioTWIN (Fei, Hillsboro, OR, USA).
évaluation de la consommation d’oxygène mitochondrial
les mitochondries ont été remises en suspension dans une solution d’analyse mitochondriale (MAS: 70 mM de saccharose, 220 mM de mannitol, 10 mm de KH2PO4, 5 mm de MgCl2, 2 mM D’HEPES, 1 mM D’EGTA et 0,2%(P/v) de BSA sans acide gras, pH 7,4 à 37 °C) et complétées par 10 mm de pyruvate, 2 mM de malate et 4 µM FCCP , pH 7.4. Un équivalent de 10 µg de protéines a été ensemencé sur des plaques XF-96 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Les plaques ont ensuite été centrifugées à 2 000 g pendant 20 min à 4 °c. nous avons visualisé la distribution des mitochondries sous un microscope à champ lumineux pour assurer une adhérence et une répartition homogène. Les plaques ont été maintenues à 37 °C sans CO2 pendant environ 40 minutes avant le chargement. Les taux de consommation d’oxygène (OCR) ont été mesurés conformément aux instructions du fabricant (Agilent/Seahorse Bioscience). Les expériences ont été reproduites dans trois puits et moyennées pour chaque condition expérimentale., Un total de 3 mesures de la consommation d’oxygène pour chaque condition ont été effectuées environ toutes les 6 minutes dans des conditions basales et après addition séquentielle de roténone (2 µM), de succinate (10 mM), d’antimycine A (40 µM) et de TMPD (N,N,N’,N’-tétraméthyl-p-phénylènediamine)/Ascorbate (100 µM/10 mM). Le Succinate a été utilisé comme donneur d’électrons pour le complexe II, la roténone comme inhibiteur du complexe I, l’antimycine A comme inhibiteur du complexe III et la respiration à travers le complexe IV a été mesurée à L’aide de TMPD/ascorbate.,
cytométrie en flux à haute sensibilité
en raison de leur petite taille, les mitochondries ont été détectées par cytométrie en flux à haute sensibilité, à l’aide d’une « option de petites particules” consistant en une diffusion directe (FSC) couplée à un tube photomultiplicateur (PMT) monté sur un produit de recherche BD FACS Canto II (SORP, BD Biosciences). Les mitochondries (0,5 µg) ont été colorées avec 1 µg d’anti-TOMM22-Atto 488 (clone IC9-2, Sigma-Aldrich) et 1 µM de mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pendant 30 minutes à 37 °C et diluées avec du PBS jusqu’à un volume final de 500 µl avant analyse par cytométrie en flux., Pour mesurer quantitativement le nombre de mitochondries, nous avons utilisé une microsphère de polystyrène de 3 µm de diamètre (Polysciences, PA, USA). 80 000 microsphères ont été ajoutées à chaque échantillon et 500 microsphères ont été acquises. Des particules de silice (Kisker Biotech, Steinfurt,Allemagne) ont été utilisées pour déterminer une échelle de taille de 100 à 1 000 nm.
extraction de L’ADN Mitochondrial par lyse alcaline
les mitochondries isolées ont été granulées à 10 000 g, 4 °C, 10 min et remises en suspension dans 0,8 mL d’ADNmt tampon D’isolement A pour chaque 3 mg de protéines mitochondriales., Les mitochondries ont ensuite été lysées dans un volume (v:v) de tampon D’isolement d’ADNmt B (préparé de manière extemporanée. 0,2 M NaOH, 1% SDS) pendant 3 min. sur la glace, sous agitation douce. les suspensions d’ADNmt ont été neutralisées avec un volume (v:v) tampon D’isolement D’ADNmt C (1,32 m d’acétate de potassium, pH 4,8 ajusté avec de l’acide acétique glacé) pendant 5 min. sur la glace, sous agitation douce. Les débris mitochondriaux ont été granulés par centrifugation pendant 10 minutes à 14 000 g, RT. les surnageants ont été transférés dans des tubes frais. l’ADNmt a été précipité pendant la nuit à -20 °C avec 0.,1 Volume (V: V) d’acétate de potassium (solution mère:3 m d’acétate de sodium, pH ajusté à 5,2 avec de l’acide acétique glacé) et 0,7 volume (v: v) d’isopropanol absolu. l’ADNmt a ensuite été granulé à 14 000 g, lavé trois fois avec 1,5 mL d’éthanol à 70% et remis en suspension dans un tampon de remise en suspension de L’ADN (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). La concentration d’ADN Mitochondrial a été déterminée par spectrophotométrie (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
isolement de noyaux dans des hépatocytes de souris
des noyaux ont été isolés dans des foies de souris à l’aide de méthodes publiées86., Brièvement, pendant les protocoles d’isolement des mitochondries, alors que des surnageants étaient utilisés pour effectuer des isolations des mitochondries, les pastilles de la première centrifugation de 700 g ont été remises en suspension dans 10 mL de tampon d’isolement des noyaux glacés A (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM saccharose. pH 7,4) et broyé dans un broyeur de tissu en verre/téflon pré-refroidi. La suspension a en outre été perturbée par trois passages à travers une aiguille de calibre 25 G5/8, suivis de deux passages à travers une aiguille de calibre 27 g½., La suspension a ensuite été filtrée sur une passoire à cellules en nylon de 40 µM (Thermo Fisher Scientific) et centrifugée à 600 g, 4 °C, 10 min. Les pastilles ont été remises en suspension dans 14 mL de tampon A et centrifugées à 600 g, 4 °C, 10 min. Les pastilles ont ensuite été remises en suspension dans 9 volumes de tampon d’isolement de noyaux glacés B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2,0 m de saccharose. pH 7,4) et centrifugé à 16 000 g, 4 °C, 30 min. Les granulés ont été remis en suspension dans 200 µL de PBS et stockés à -20 °C.,
isolement de cellules entières et d’ADN nucléaire
L’ADN de 25 mg de foie de souris entier ou de 200 µL ou de noyaux isolés a été extrait à L’aide de QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen), en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons ont été élués dans un tampon de remise en suspension de L’ADN.,
enrichissement de l’ADN Mitochondrial et de l’ADN nucléaire par qPCR
trente nanogrammes d’ADN mitochondrial, D’ADN nucléaire ou de la même quantité d’ADN total extrait du foie entier de souris en utilisant les protocoles susmentionnés, ont été amplifiés dans un cycleur Q temps réel qPCR de Rotor-gène (QIAgen) selon les protocoles standard avec SsoAdvanced Universal SYBR® green Supermix (BioRad) dans un volume de réaction de 10 µL., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
digestion de L’ADN Mitochondrial par des enzymes de restriction
L’ADNmt purifié de souris a été digéré par des endonucléases de restriction AOH II ou Pst I (ONÉ, Whitby, ON, Canada) selon le protocole du fabricant. Les produits digérés (1,5 µg) ont ensuite été résolus sur un gel d’agarose à 0,5% (p/v). Les Images ont été acquises sur un système de documentation sur gel Chemidoc MP (Bio-Rad). Le gel sur toute la longueur est présenté dans la Fig. 6d.,
traitement par nucléase S1 de L’ADN mitochondrial et de l’ADN nucléaire
30 µg d’ADNmt et d’adnn ont été dilués dans 200 µL de 1x tampon S1 et traités avec 50 nucléase U S1 (Thermo Fischer Scientific) pendant 5 minutes à 37 °C. La réaction a été arrêtée par addition de 600 mM D’EDTA (concentration finale) et incubation à 70 °C pendant 10 minutes. Les échantillons ont été précipités par addition de 300 mm D’acétate de Sodium (concentration finale) et de 2 volumes (v:v) d’éthanol absolu pendant 16 heures à -20 °C., Les échantillons ont été granulés à 14 000 g, RT, 20 minutes, et lavés 1 mL d’éthanol à 70% et remis en suspension dans un tampon de remise en suspension de l’ADN. Pour les tests de compétition, l’adnn et l’ADNmt non traités ont suivi le même traitement sans addition de l’enzyme. Les échantillons ont été dosés par qPCR.
oxydation des mitochondries in vitro
des mitochondries dosées ont été granulées et remises en suspension à une concentration de 1,5 mg de protéines mitochondriales / mL dans du PBS contenant 500 µM d’hydroperoxyde de tertbutyle oxydant (TBHP) (Sigma-Aldrich)., Les mitochondries ont été oxydées pendant 1 h 30 min à 37 °C sous agitation douce puis rincées deux fois avec du PBS glacé. Les mitochondries oxydées ont ensuite été quantifiées par le BCA.
oxydation des lipides mitochondriaux
la formation de substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) a été évaluée à l’aide du kit de paramètres TBARS (R&d systems, Minneapolis, MN, USA), en suivant les instructions du fabricant. Deux cents microgrammes de mitochondries ont été lysés, les protéines ont été précipitées à l’aide d’acide trichloroacétique (TCA) et granulées à 12 000 g, Température ambiante, 4 min., Les surnageants ont été transférés dans des tubes frais. Des échantillons (75 µL) ont été incubés avec 37,5 µL d’acide thiobarbiturique dans une plaque de 96 puits pendant 3 h à 50 °C. Les Absorbances ont été lues à 532 nm sur un lecteur de microplaques SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) et la quantification de TBARS a été effectuée à l’aide d’une courbe standard fournie dans le kit. Des échantillons oxydés ont été comparés à des mitochondries témoins incubées dans les mêmes conditions dans des PBS dépourvus de TBHP.,
oxydation des protéines mitochondriales
la formation de fractions carbonylées à la suite de l’oxydation mitochondriale in vitro a été mesurée à l’aide de la trousse D’analyse de la teneur en protéines Carbonylées (Sigma Aldrich) suivant les instructions du fabricant. Des échantillons oxydés ont été comparés à des mitochondries témoins incubées dans les mêmes conditions dans des PBS dépourvus de TBHP.,
détection D’anticorps ciblant les épitopes mitochondriaux par ELISA
pour la détection d’anticorps mitochondriaux anti-entiers (AwMA), les mitochondries murines ont été diluées (500 µg/mL) dans un tampon carbonate / bicarbonate de 50 mM, pH 9,6 et 25 µL par puits ont été chargés sur des microplaques de polystyrène à fond plat transparent à Les plaques ont été enrobées pendant 18 h à 4 °C puis bloquées pendant 4 h à 37 °C avec du PBS contenant 10% de FBS et 0,5% de gélatine. Après trois lavages avec du PBS, les sérums sont dilués 1:150 (sauf indication contraire) dans du PBS-10% FBS-0.,3% de gélatine ont été incubés pendant une nuit à 4 °C en double. Après trois lavages avec du PBS, les plaques ont été incubées pendant 1 h à température ambiante avec un anti-souris de chèvre conjugué à la phosphatase alcaline(AP) ou des IgG anti-humains (Sigma-Aldrich) dilués 1:1 000 dans de L’albumine sérique bovine (BSA) à 0,4% de PBS. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS et développées avec du phosphate de P-nitrophénol (P-NPP) pendant environ 30 min à 37 °C et les densités optiques (OD) ont été lues à 405 nm sur un lecteur de microplaque., Le même protocole a été utilisé pour la détection d’autoanticorps ciblant les particules submitochondriales en utilisant 25 µL par puits de SMP dilué (50 µg/mL) dans un tampon carbonate/bicarbonate de 50 mM, pH 9,6. Une approche similaire a été utilisée pour les mitochondries humaines avec la modification suivante:les plaques ont été incubées avec un anticorps secondaire anti-IgG humain conjugué à la peroxydase de raifort (1: 3 000), l’activité peroxydase a été révélée à température ambiante pendant ~5 min avec la 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB). La réaction a été arrêtée avec 2 N H2SO4 et l’ODs lue à 450 nm., Pour L’anti-ADNmt ELISA, les plaques ont été pré-enduites de sulfate de protamine à 1% dans de l’eau double distillée pendant 1 h à température ambiante. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS et enduites pendant la nuit à 4 °C avec 400 ng d’ADNmt dans du PBS. Toutes les étapes suivantes étaient identiques à celles utilisées pour AwMA-Elisa. Les valeurs vides (antigènes mitochondriaux et aucun sérum) ont été soustraites des valeurs mesurées pour chaque patient. Au cours du développement de ces tests, le revêtement approprié des puits a été testé en utilisant des anticorps monoclonaux de souris appariés par isotype (mAb). Un anticorps monoclonal (Clone IV.,3, 4 µg/mL) a été utilisé comme témoin négatif dans chaque cas tandis que différents anticorps monoclonaux ont été utilisés, en fonction des antigènes de revêtement, comme témoins positifs: un anti-TOMM22 mAb (Clone IC9-2, 4 µg / mL. Abcam) pour les mitochondries intactes, un mAb anti-ADN (clone 35I9 ADN, 10 µg / mL. Abcam) ou un anti-Cytochrome C mAb (Clone 7H8. 2c12, 5 µg/mL. BD Biosciences).,
essai de compétition
AwMA-Elisa a été réalisé comme décrit dans les sections précédentes avec les modifications suivantes: des échantillons de sérum ont été pré-incubés dans un tampon de dilution (1:150) dopé avec diverses concentrations (0,25, 1 et 3 mg / mL) de concurrents (c.-à-d. mitochondries ou microparticules de globules rouges) pendant 3 heures. à RT et incubé en double pendant la nuit à 4 °C. Les données sont présentées comme le pourcentage de signal restant après chaque compétition, par rapport à la DO (405 nm) mesurée en l’absence de concurrents.,
une procédure similaire a été utilisée pour L’AmtDNA-ELISA, en utilisant des concentrations accrues (0, 3, 9 et 27 ng / µL) d’ADN concurrent (extrait de noyaux ou de mitochondries, avec ou sans traitement par nucléase S1).
statistiques
Les comparaisons entre les groupes ont été faites à l’aide du test T de Student, du test de Wilcoxon, des tests de Friedman ou de Kruskal-Wallis, De L’ANOVA à Sens Unique, de l’ANOVA à deux voies ou de mesures répétées en fonction du résultat, ainsi que du nombre et du type de groupes., Lorsque plusieurs comparaisons ont été évaluées, des tests correctifs post-hoc appropriés ont été utilisés, tels que Dunn, Dunnett, Sidak ou Bonferroni. les Associations entre AwMA, AmtDNA et anti-HSP60 ont été calculées avec des corrélations de Spearman. La Distribution de ces anticorps selon les résultats de L’ACA a été comparée à L’aide du test de Wilcoxon. Les Associations entre AwMA ou AmtDNA et les résultats cliniques ont été étudiées par régressions linéaires et logistiques bivariées et multivariées., Les résultats cliniques étudiés sont l’épaisseur moyenne du milieu intima, la variation en pourcentage de la dilatation médiée par le flux (FMD) de l’artère brachiale, la présence de fièvre aphteuse, la présence de plaque dans la carotide, l’événement thrombotique ever, le nombre de globules blancs, le nombre de plaquettes, l’augmentation de la liaison à l’ADN par le dosage Farr au-dessus de la plage normale pour le laboratoire d’essai, la présence de dommages selon L’indice de dommages SLICC (SDI > 0), une activité élevée selon le score D’activité SLEDAI-2K (sledai ≥ 4), présence de néphrite lupique, classe de biopsie, ainsi que chronicité et indice d’activité de la biopsie., Ces derniers ont été ajustés en fonction de la durée de la maladie, de l’âge, de l’indice de masse corporelle (IMC), du cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL), des médicaments antipaludiques et de la prednisone. Les régressions logistiques sont présentées avec des rapports impairs et leur intervalle de confiance Wald de 95%. Les résultats des Participants ont été considérés comme positifs pour L’AwMA et L’AmtDNA lorsque leur valeur était supérieure à la valeur seuil identifiée après avoir maximisé L’indice de Youden. Un intervalle de confiance de 95% a été obtenu pour la coupure à l’aide de 10 000 échantillons bootstrap. Les mesures du rendement sont présentées avec leur intervalle de confiance exact de 95%.,
logiciel
Les images Western blot ont été acquises à L’aide des chiffres 5.2 D’Image Studio (biotechnologie LI-COR). la migration de l’ADNmt à travers le gel d’agarose a été imagée à L’aide D’Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). Les études DLS ont été réalisées à l’aide du logiciel intégré Zetasizer 7.10 (Malvern Instruments). Les images EM ont été acquises avec le logiciel de Capture D’Image 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). La cytométrie en flux a été réalisée à L’aide du BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences). Les rendements des isolations D’ADN ont été quantifiés à l’aide du ND-1000 3.8.,1 logiciel (Thermo Fisher Scientific) et qPCR ont été réalisés avec RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Les densités optiques ont été mesurées à L’aide de SoftMax Pro 5.4.1 (Molecular Devices). Les chiffres ont été assemblés avec ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) et Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) et SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).