Anti-mitocondriali autoanticorpi nel lupus eritematoso sistemico e la loro associazione con manifestazioni di malattia
Studio di approvazione
popolazione di Pazienti
L’uomo sieri testati in questo studio sono stati ottenuti da un University Health Network di ricerca etica consiglio (REB) approvato studio di SLE e pazienti con APS, a Toronto, così come da controlli sani e pazienti con PBC reclutati da CHU de Quebec Université Laval REB studi approvati in Quebec City., I pazienti con LES dovevano soddisfare i criteri di classificazione ACR del 1982 per SLE rivisti nel 199781,82 e i pazienti con APS soddisfacevano i criteri Sapporo del 1999 per APS rivisti nel 200683,84. Per SLE, pazienti di sesso femminile consecutivi dell’Università di Toronto Lupus Clinic (UTLC) sono stati avvicinati e hanno fornito il consenso tra agosto 2010 e ottobre 2011 per far parte di uno studio sul ruolo degli acidi grassi e delle malattie cardiovascolari nel lupus. Hanno fornito un campione di sangue e avevano i loro dati clinici anonimizzati collegati al loro biospecimen., Allo stesso modo, i pazienti APS visti presso la clinica di reumatologia a Toronto sono stati avvicinati seguendo una procedura simile. Tutti i restanti biospecimen potrebbero essere utilizzati per futuri studi sui biomarcatori del lupus secondo il consenso dei soggetti originali. Volontari sani di controllo sono stati reclutati come parte dello studio sui marcatori di infiammazione se non avevano malattie note e non avevano sintomi infettivi al momento del prelievo di sangue. Età e sesso sono stati raccolti in quel momento. I pazienti affetti da PBC hanno soddisfatto i criteri di classificazione PBC del 2009, riveduti nel 201838,85, inclusa la positività per gli anticorpi anti-mitocondriali.,
I dati dei laboratori clinici
Per i pazienti con LES, l’anti-dsDNA è stato misurato utilizzando il test Farr (cut-off di laboratorio del 30%) e l’anti-cardiolipina (cut – off di laboratorio IgG e IgM di 40 unità GPL o MPL) sono stati misurati mediante ELISA in un laboratorio clinico.
Coltura cellulare
Modello murino inducibile di SLE
Le raccomandazioni del Consiglio canadese sulla cura degli animali sono state seguite in un protocollo approvato dal Comitato per il benessere degli animali dell’Université Laval., C57BL / 6 J sono stati ottenuti da Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) e alloggiati in una struttura per animali senza patogeni specifici Elite-Plus a CHU de Quebec. Gli autoanticorpi LES sono stati indotti in questi topi come descritto in precedenza63. In breve, i topi maschi di 6-8 settimane hanno ricevuto iniezioni endovenose di 100 µL di ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA) seguite 24 h più tardi da un’iniezione endovenosa di 100 µL di lipopolisaccaride (LPS da E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Queste iniezioni sono state ripetute dopo 2 e 4 settimane per un totale di tre cicli di immunizzazioni e topi sono stati dissanguati 48 h dopo la terza immunizzazione. Come controlli sono stati utilizzati topi C57BL / 6 J iniettati per via endovenosa con PBS nello stesso programma.
Etica
Durante l’intero studio, sono stati ottenuti campioni di sangue da pazienti con consenso informato. Tutti i metodi presentati in questo studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti per i donatori umani e murini.,
Isolamento dei mitocondri
I mitocondri sono stati isolati dai fegati dei topi C57BL / 6 J a seguito di una combinazione di protocolli pubblicati61,62. I topi sono stati sacrificati dalla dislocazione cervicale, il fegato è stato rapidamente rimosso, la cistifellea asportata e il fegato è stato risciacquato in PBS ghiacciato (137 mm NaCl, 3 mM KCl, 19 mm Na2HPO4, 2 mm KH2PO4)., Il fegato è stato quindi macinato e trasferito in una smerigliatrice di tessuto di vetro/teflon pre-raffreddata contenente 12 ml di tampone di isolamento mitocondriale ghiacciato (10 mm Tris, 1 mm EGTA, 200 mM saccarosio) per grammo di fegato, quindi macinato fino a ottenere una sospensione omogenea. Cellule e nuclei intatti sono stati pellettati due volte a 700 g, 4 °C, 10 min. Membrane contaminanti, proteine e organelli sono stati eliminati con due centrifughe a 7.000 g, 4 ° C, 10 min seguite da una centrifugazione a 10.000 g, 4 °C, 10 min., La sospensione mitocondriale grezza è stata ulteriormente purificata mediante ultracentrifugazione contro un gradiente di Percoll (10 mm Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) a 95.000 g, 4 °C, 30 min. La banda contenente i mitocondri è stata raccolta in PBS. Un approccio simile è stato utilizzato per isolare i mitocondri umani con l’eccezione che fino a 107 cellule Hep-G2 sono state lisate da passaggi ripetuti attraverso un ago a scartamento ridotto., Il kit commerciale QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Germania) è stato anche utilizzato, seguendo le istruzioni del produttore, per isolare i mitocondri dalle cellule Hep-G2 per il confronto della qualità mediante western blotting con il suddetto protocollo. I mitocondri isolati sono stati dosati con il metodo dell’acido bicinchoninico (BCA) utilizzando il kit di analisi della proteina BCA (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). I mitocondri appena isolati sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti ad eccezione dei preparati di particelle submitocondriali per i quali i mitocondri pellettati sono stati mantenuti a -80 ° C fino al momento del bisogno.,
Preparazione delle particelle submitocondriali (SMP)
le SMP sono state preparate come descritto altramente60. In breve, i mitocondri congelati sono stati scongelati a temperatura ambiente e diluiti a 10 mg di proteine mitocondriali in 10 mm di acido 4-morfolinepropansolfonico (MOPS). I campioni sono stati poi sonicati utilizzando un Fisher Sonic Dismembrator modello 500 (Thermo Scientific) al 20% di uscita massima per 20 secondi, quindi tenuti su un bagno di acqua salata-ghiaccio per 10 minuti. Questo ciclo è stato ripetuto nove volte., I campioni sono stati quindi centrifugati a 16.000 g, 4 °C, 10 minuti per eliminare i mitocondri ininterrotti e altri detriti indesiderati. I supernatanti sono stati raccolti in una provetta fresca e i loro volumi regolati a 2 mL in MOP da 10 mm. I campioni sono stati poi ultracentrifugati a 150.000 g, 4 °C per 45 minuti. L’SMP pellettato è stato risospeso in tampone SMP (mannitolo 225 mm, saccarosio 75 mm, HEPES 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4) e dosato. I preparati SMP sono stati mantenuti a -80 °C fino a quando necessario.,
Microparticelle di globuli rossi (RBCMP) preparazione
I globuli rossi (RBC) sono stati isolati dal sangue di volontari umani sani mediante centrifugazione a 282 g per 10 minuti a RT. Plasma ricco di piastrine e buffy coat sono stati scartati e la frazione RBC mantenuta. RBC sono stati contati (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) e regolati ad una concentrazione di 5 × 108 cellule/mL nel buffer di Tyrode (12 mM NaHCO3, 127 mm NaCl, 5 mm KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mm Glucosio, 10 mm HEPES, pH 7,4)., 109 cellule sono state quindi diluite in 45 ml di acqua doppia distillata e incubate per 5 minuti. La tonicità del tampone è stata poi bilanciata con l’aggiunta di 5 ml di PBS 10X (filtrato attraverso una membrana da 0,22 µm). I residui di RBC sono stati rimossi mediante centrifugazione a 1.300 g per 5 minuti a RT e il surnatante è stato centrifugato a 18.000 g per 90 minuti a 18 °C. Il pellet di microparticelle RBC è stato quindi sospeso in 500 µl di PBS. La concentrazione di proteine è stata misurata con il test BCA.,
Western blotting
Misurazione della dimensione mitocondriale mediante dynamic light scattering (DLS)
La dimensione dei mitocondri isolati è stata misurata da DLS, utilizzando un dispositivo Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments, Malvern, UK) equipaggiato con il laser He-Ne standard da 4 mW, 633 nm come sorgente luminosa, impostato ad un angolo di rilevamento di 173°. Gli esperimenti sono stati replicati tre volte in cuvette UV monouso di lunghezza 1 cm (Brand GMBH, Wertheim, Germania) contenenti 100 µL di mitocondri murini isolati diluiti in PBS ad una concentrazione di proteine 10 µg/µL., I seguenti parametri sono stati presi in considerazione al momento di misurare la dimensione della mitocondriale: indice di rifrazione del solvente: 1.330, la viscosità del campione: 0.8872 mPas, indice di rifrazione delle proteine: 1.45, temperatura: 25 °C.
microscopia elettronica
Mitocondri (108) sono stati corretti con il 3,5% di acroleina per 15 min a temperatura ambiente. I campioni fissi sono stati risciacquati due volte in PBS quindi incorporati in agarosio al 4%. le sezioni di 50 µm sono state tagliate utilizzando un vibratomo, post-fissato in tetrossido di osmio all ‘ 1% per 30 minuti e incorporato in resina Durcupan., Sezioni ultrasottili di settanta nanometri sono state visualizzate a 80 kV utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI, Hillsboro, OR, USA).
Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale
I mitocondri sono stati risospesi in soluzione di saggio mitocondriale (MAS: 70 mM saccarosio, 220 mm mannitolo, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mm HEPES, 1 mM EGTA e 0,2%(p/v) BSA senza acidi grassi, pH 7,4 a 37 °C) e integrati con 10 mM piruvato, 2 mm malato e 4 µM FCCP , pH 7.4. Un equivalente di proteine 10 µg è stato seminato su piastre XF – 96 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Le piastre sono state quindi centrifugate 2.000 g per 20 min a 4 °C. Abbiamo visualizzato la distribuzione dei mitocondri sotto un microscopio a campo luminoso per garantire aderenza e ripartizione omogenea. Le piastre sono state mantenute a 37 °C senza CO2 per circa 40 minuti prima del carico. I tassi di consumo di ossigeno (OCR) sono stati misurati in conformità con le istruzioni del produttore (Agilent/Seahorse Bioscience). Gli esperimenti sono stati replicati in tre pozzetti e in media per ogni condizione sperimentale., Un totale di 3 misurazioni del consumo di ossigeno per ogni condizione sono state effettuate approssimativamente ogni 6 minuti in condizioni basali e dopo aggiunta sequenziale di rotenone (2 µM), succinato (10 mM), antimicina A (40 µM) e TMPD (N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiammina)/Ascorbato (100 µM/10 mM). Il succinato è stato utilizzato come donatore di elettroni per il complesso II, il rotenone come inibitore complesso I, l’antimicina A come inibitore complesso III e la respirazione attraverso il complesso IV è stata misurata utilizzando TMPD/ascorbato.,
Citometria a flusso ad alta sensibilità
A causa delle loro piccole dimensioni, i mitocondri sono stati rilevati mediante citometria a flusso ad alta sensibilità, utilizzando una “small particle option” costituita da una dispersione diretta (FSC) accoppiata a un tubo fotomoltiplicatore (PMT) montato su un prodotto di ricerca BD FACS Canto II Special Order (SORP, BD Biosciences). I mitocondri (0,5 µg) sono stati colorati con 1 µg di anti-TOMM22-Atto 488 (clone IC9-2, Sigma-Aldrich) e 1 µM di mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) per 30 minuti a 37 °C e diluiti con PBS fino a un volume finale di 500 µl prima dell’analisi della citometria a flusso., Per misurare quantitativamente il numero di mitocondri, abbiamo utilizzato microsfere di polistirene di diametro 3 µm (Polysciences, PA, USA). Sono state aggiunte 80.000 microsfere a ciascun campione e sono state acquisite 500 microsfere. Le particelle di silice (Kisker Biotech, Steinfurt, Germania) sono state utilizzate per determinare la scala di dimensioni di 100-1.000 nm.
Estrazione del DNA mitocondriale mediante lisi alcalina
I mitocondri isolati sono stati pellettati a 10.000 g, 4 °C, 10 min e risospesi in tampone di isolamento mtDNA A da 0,8 mL per ogni 3 mg di proteine mitocondriali., I mitocondri sono stati poi lizzati in un volume (v:v) tampone di isolamento mtDNA B (preparato estemporaneamente. 0.2 M NaOH, 1% SDS) per 3 min. sul ghiaccio, sotto leggera agitazione. Le sospensioni mtDNA sono state neutralizzate con un volume (v:v) tampone di isolamento mtDNA C (1,32 M di acetato di potassio, pH 4,8 regolato con acido acetico ghiacciato) per 5 min. sul ghiaccio, sotto leggera agitazione. I detriti mitocondriali sono stati pellettati mediante centrifugazione per 10 minuti a 14.000 g, RT. I supernatanti sono stati trasferiti in tubi freschi. mtDNA è stato precipitato durante la notte a -20 °C con 0.,1 volume (v:v) acetato di potassio (soluzione madre: 3 M acetato di sodio, pH aggiustato a 5,2 con acido acetico ghiacciato) e 0,7 volume (v:v) isopropanolo assoluto. L’mtDNA è stato quindi pellettato a 14.000 g, lavato tre volte con 1,5 ml di etanolo al 70% e risospeso in tampone di risospensione del DNA (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). La concentrazione di DNA mitocondriale è stata determinata mediante spettrofotometria (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
Isolamento dei nuclei dagli epatociti di topo
I nuclei sono stati isolati dai fegati di topo utilizzando metodi pubblici86., In breve, durante i protocolli di isolamento dei mitocondri, mentre i supernatanti sono stati utilizzati per eseguire isolamenti dei mitocondri, i pellet della prima centrifugazione da 700 g sono stati risospesi in 10 mL di tampone di isolamento dei nuclei ghiacciati A (5 mm MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM Saccarosio. pH 7.4) e macinato in una smerigliatrice pre-raffreddata del tessuto del teflon / del vetro. La sospensione è stata ulteriormente interrotta da tre passaggi attraverso un ago calibro 25 G5/8 seguiti da due passaggi attraverso un ago calibro 27 G½., La sospensione è stata quindi filtrata contro un filtro a celle di nylon da 40 µM (Thermo Fisher Scientific) e centrifugata a 600 g, 4 °C, 10 min. I pellet sono stati risospesi in tampone A da 14 ml e centrifugati a 600 g, 4 °C, 10 min. I pellet sono stati quindi risospesi in 9 volumi di tampone di isolamento dei nuclei ghiacciati B (1 mm MgCl2, 10 mM Tris– HCl, 2,0 M di saccarosio. pH 7,4) e centrifugato a 16.000 g, 4 °C, 30 min. I pellet sono stati risospesi in 200 µL di PBS e conservati a -20 °C.,
Isolamento di DNA a cellule intere e nucleari
Il DNA da 25 mg di fegato intero di topo o da 200 µL o nuclei isolati è stato estratto utilizzando QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen), seguendo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati eluiti nel tampone di risospensione del DNA.,
il DNA Mitocondriale e DNA nucleare arricchimenti da qPCR
Trenta nanogrammi di DNA mitocondriale, DNA nucleare o la stessa quantità di DNA totale estratto da tutto il fegato del mouse utilizzando il suddetto protocolli, sono stati amplificati in un Rotor-Gene Q real time qPCR cycler (QIAgen) secondo protocolli standard con SsoAdvanced Universale SYBR® Green Supermix (BioRad), che in 10 µL di volume di reazione., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
Digestione del DNA mitocondriale mediante enzimi di restrizione
L’mtDNA purificato del topo è stato digerito dalle endonucleasi di restrizione Hae II o Pst I (NEB, Whitby, ON, Canada) secondo il protocollo del produttore. I prodotti digeriti (1,5 µg) sono stati quindi risolti su un gel di agarosio allo 0,5% (p/v). Le immagini sono state acquisite su un sistema di documentazione gel Chemidoc MP (Bio-Rad). Gel full-length è presentato in Fig supplementare. 6d.,
nucleasi S1 trattamento del DNA mitocondriale e DNA nucleare
30 µg di dna mitocondriale e nDNA sono stati diluiti in 200 µL di 1X S1-buffer e trattati con 50 U S1 nucleasi (Thermo Fischer Scientific) per 5 minuti a 37 °C. la Reazione è stata interrotta da oltre 600 mM EDTA (concentrazione finale) e l’incubazione a 70 °C per 10 minuti. I campioni sono stati precipitati mediante aggiunta di acetato di sodio 300 mm (concentrazione finale) e 2 volumi (v:v) di etanolo assoluto per 16 ore a -20 °C., I campioni sono stati pellettati a 14.000 g, RT, 20 minuti, e lavati 1 ml di etanolo al 70% e risospesi in tampone di risospensione del DNA. Per le analisi della concorrenza, nDNA non trattato e mtDNA hanno seguito lo stesso trattamento senza aggiunta dell’enzima. I campioni sono stati dosati da qPCR.
Mitocondri ossidazione in vitro
I mitocondri dosati sono stati pellettati e risospesi ad una concentrazione di 1,5 mg di proteine mitocondriali / mL in PBS contenenti 500 µM dell’ossidante tertbutil idroperossido (TBHP) (Sigma-Aldrich)., I mitocondri sono stati ossidati per 1 ora e 30 minuti a 37 °C sotto leggera agitazione, quindi risciacquati due volte con PBS ghiacciato. I mitocondri ossidati sono stati successivamente quantificati da BCA.
Ossidazione dei lipidi mitocondriali
La formazione di sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS) è stata valutata utilizzando il TBARS Parameter Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA), seguendo le istruzioni del produttore. Duecento microgrammi di mitocondri sono stati lisati, le proteine sono state precipitate usando acido tricloroacetico (TCA) e pellettate a 12.000 g, temperatura ambiente, 4 min., I supernatanti sono stati trasferiti in tubi freschi. I campioni (75 µL) sono stati incubati con 37,5 µL di acido tiobarbiturico in una piastra a 96 pozzetti per 3 ore a 50 °C. Le assorbenze sono state lette a 532 nm su un lettore di micropiastre SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) e la quantificazione TBARS è stata eseguita utilizzando una curva standard fornita nel kit. I campioni ossidati sono stati confrontati con i mitocondri di controllo che sono stati incubati nelle stesse condizioni in PBS privi di TBHP.,
Ossidazione delle proteine mitocondriali
La formazione di parti carboniliche a seguito di ossidazione mitocondriale in vitro è stata misurata utilizzando il Protein Carbonyl Content Assay Kit (Sigma Aldrich) seguendo le istruzioni del produttore. I campioni ossidati sono stati confrontati con i mitocondri di controllo che sono stati incubati nelle stesse condizioni in PBS privi di TBHP.,
Rilevazione di anticorpi mirati agli epitopi mitocondriali mediante ELISA
Per la rilevazione di anticorpi mitocondriali anti-interi (AwMA), i mitocondri murini sono stati diluiti (500 µg/mL) in tampone carbonato / bicarbonato da 50 mm, pH 9,6 e 25 µL per pozzetto sono stati caricati su micropiastre di polistirene a fondo piatto trasparente a mezza area da 96 pozzetti (Corning, New York, USA). Le piastre sono state rivestite per 18 ore a 4 °C, quindi bloccate per 4 ore a 37 °C con PBS contenente 10% FBS e 0,5% gelatina. Dopo tre lavaggi con PBS, sera diluito 1:150 (se non diversamente specificato) in PBS-10% FBS-0.,il 3% di gelatina è stato incubato durante la notte a 4 °C in duplice copia. Dopo tre lavaggi con PBS, le piastre sono state incubate per 1 h a temperatura ambiente con fosfatasi alcalina-(AP) coniugato capra anti-topo o anti-umano IgG (Sigma-Aldrich) diluito 1:1.000 in PBS-0,4% albumina sierica bovina (BSA). Le piastre sono state lavate tre volte con PBS e sviluppate con p-nitrofenolo fosfato (p-NPP) per ~30 min a 37 °C e le densità ottiche (OD) sono state lette a 405 nm su un lettore di micropiastre., Lo stesso protocollo è stato utilizzato per il rilevamento di autoanticorpi mirati a particelle submitocondriali utilizzando 25 µL per pozzetto di SMP diluito (50 µg/mL) in tampone carbonato/bicarbonato da 50 mm, pH 9,6. Un approccio simile è stato utilizzato per i mitocondri umani con la seguente modifica:le piastre sono state incubate con un anticorpo secondario anti-IgG coniugato con perossidasi di rafano (1: 3.000), l’attività della perossidasi è stata rivelata a temperatura ambiente per ~5 min con 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB). La reazione è stata interrotta con 2 N H2SO4 e l’ODs letto a 450 nm., Per l’ELISA anti-mtDNA, le piastre sono state pre-rivestite con 1% di solfato di protamina in acqua doppia distillata per 1 h a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate tre volte con PBS e rivestite durante la notte a 4 °C con 400 ng mtDNA in PBS. Tutti i passaggi successivi erano identici a quelli utilizzati per AwMA-ELISAs. I valori in bianco (antigeni mitocondriali e nessun sieri) sono stati sottratti dai valori misurati per ciascun paziente. Durante lo sviluppo di questi test, è stato testato il corretto rivestimento dei pozzetti utilizzando anticorpi monoclonali di topo isotipo-abbinati (mAb). Un anticorpo monoclonale (Clone IV.,3, 4 µg / mL) è stato utilizzato come controllo del test negativo in ogni caso, mentre diversi anticorpi monoclonali sono stati utilizzati, a seconda degli antigeni di rivestimento, come controlli positivi: un anti-TOMM22 mAb (Clone IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) per i mitocondri intatti, un anti-DNA mAb (Clone 35I9 DNA, 10 µg / mL. Abcam) o un anti-citocromo C mAb (Clone 7H8.2C12, 5 µg/mL. BD Biosciences).,
test di Competizione
AwMA-Elisa sono stati eseguiti come descritto nelle sezioni precedenti, con le seguenti modifiche: campioni di siero sono stati pre-incubati in tampone di diluizione (1:150) a spillo con diverse concentrazioni (0.25, 1 e 3 mg/mL) di concorrenti (cioè mitocondri o globuli rossi microparticelle) per 3 ore. a RT e incubato in duplice copia durante la notte a 4 °C. I dati sono presentati come la percentuale di segnale rimanente dopo ogni competizione, rispetto al OD (405 nm) misurata in assenza di concorrenti.,
Una procedura simile è stata utilizzata per l’AMTDNA-ELISA, utilizzando concentrazioni aumentate (0, 3, 9 e 27 ng / µL) di DNA concorrente (estratto da nuclei o mitocondri, con o senza trattamento con S1 nucleasi).
Statistiche
I confronti tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando il t-test dello studente, il test di Wilcoxon, i test di Friedman o Kruskal-Wallis, ANOVA a senso unico, ANOVA a due vie o misure ripetute a seconda del risultato, così come il numero e il tipo di gruppi., Quando sono stati valutati confronti multipli, sono stati utilizzati appropriati test di correzione post-hoc come Dunn, Dunnett, Sidak o Bonferroni. Le associazioni tra AwMA, AmtDNA e anti-HSP60 sono state calcolate con correlazioni di Spearman. Distribuzione di questi anticorpi in base ai risultati ACA sono stati confrontati utilizzando il test di Wilcoxon. Le associazioni tra AwMA o AmtDNA e gli esiti clinici sono stati studiati mediante regressioni lineari e logistiche bivariate e multivariate., I risultati clinici di studio media intima media spessore variazione percentuale della dilatazione flusso mediata (FMD) dell’arteria brachiale, la presenza di afta epizootica, la presenza di placca in carotide, evento trombotico mai, globuli bianchi, conta piastrinica, aumento di legame del DNA da Farr dosaggio di sopra del range di normalità per i test di laboratorio, la presenza di danni secondo SLICC Indice di Danno (SDI > 0), ad alta attività secondo SLEDAI-2K punteggio di attività (SLEDAI ≥ 4), presenza di nefrite di lupus, biopsia di classe, così come cronicità e l’indice di attività da biopsia., Questi ultimi sono stati aggiustati per durata della malattia, età, indice di massa corporea (BMI), lipoproteine a bassa densità (LDL) colesterolo, farmaci antimalarici e prednisone. Le regressioni logistiche sono presentate con rapporti dispari e il loro intervallo di confidenza Wald del 95%. I risultati dei partecipanti sono stati considerati positivi per AwMA e AmtDNA quando il loro valore era superiore al valore di cut-off identificato dopo aver massimizzato l’indice di Youden. Un intervallo di confidenza del 95% è stato ottenuto per il cut-off utilizzando 10.000 campioni di bootstrap. Le misure di prestazione sono presentate con il loro intervallo di confidenza esatto di 95%.,
Software
Le immagini Western blot sono state acquisite utilizzando Image Studio Digits 5.2 (LI-COR biotechnology). La migrazione del mtDNA attraverso il gel di agarosio è stata imaginata utilizzando Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). Gli studi DLS sono stati effettuati utilizzando il software Zetasizer 7.10 integrato (Malvern Instruments). Le immagini EM sono state acquisite con il software di acquisizione immagini 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). La citometria a flusso è stata eseguita utilizzando BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences). I rendimenti da isolamenti del DNA sono stati quantificati usando il ND-1000 3.8.,1 software (Thermo Fisher Scientific) e qPCR sono stati eseguiti con RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Le densità ottiche sono state misurate utilizzando SoftMax Pro 5.4.1 (Dispositivi molecolari). Le figure sono state assemblate con ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) e Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, Stati Uniti d’America). Le analisi statistiche sono state effettuate con il software Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) e SAS versione 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, Stati Uniti d’America).