Anti-mitokondriális autoantitestek a szisztémás lupus erythematosus, valamint az egyesület betegség megnyilvánulásai
Tanulmányt jóváhagyó
betegcsoportban
Az emberi sera vizsgált ebben a vizsgálatban nyert el az Egyetem, Egészségügyi Hálózat kutatás etikai bizottság (REB) jóváhagyott tanulmány az SLE, valamint APS betegek Torontóban, valamint az egészséges kontrollok, valamint PBC betegek, akiket a CHU de Québec – Université Laval REB jóváhagyott vizsgálatok Quebec City., Az SLE-ben szenvedő betegeknek meg kellett felelniük az 1997-ben felülvizsgált SLE 1982-es ACR-osztályozási kritériumainak, és az APS-ben szenvedő betegeknek teljesíteniük kellett a 2006-ban felülvizsgált APS 1999-es Sapporo-kritériumait83,84. Az SLE esetében 2010 augusztusa és 2011 októbere között a Torontói Egyetem Lupusklinikájának (UTLC) egy, a zsírsavak és a szív-és érrendszeri betegségek lupusban betöltött szerepéről szóló tanulmányának részét képezték. Egy vérmintát adtak át, és anonimizált klinikai adataikat a biospecimenjükhöz kapcsolták., Hasonlóképpen, a torontói reumatológiai klinikán látott APS-betegeket hasonló eljárást követően közelítették meg. Az összes fennmaradó biospecimen felhasználható a lupus biomarkereire vonatkozó jövőbeli vizsgálatokhoz az eredeti alanyok beleegyezése szerint. Egészséges kontroll önkénteseket toboroztak a gyulladás markereire vonatkozó vizsgálat részeként, ha nem voltak ismert betegségeik, és a vérvétel idején nem voltak fertőző tüneteik. Az életkor és a nem abban az időben gyűlt össze. A PBC-betegek teljesítették a 2009-es PBC-osztályozási kritériumokat, amelyeket 2018-ban felülvizsgáltak38,85, beleértve az anti-mitokondriális antitestek pozitivitását.,
klinikai laboratóriumok adatai
SLE betegek esetében az anti-dsDNS-t a Farr-vizsgálat (30% – os laboratóriumi cut-off) és az anti-cardiolipin (IgG és IgM-40 GPL vagy MPL egység laboratóriumi cut-off) segítségével mérték az ELISA-val egy klinikai laboratóriumban.
sejttenyészet
az SLE indukálható egérmodelljét
A Kanadai állatgondozási Tanács ajánlásait az Université Laval állatjóléti Bizottsága által jóváhagyott jegyzőkönyv követte., A C57bl / 6 J-t a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor, ME, USA) szerezték be, és a CHU de Quebec-i Elite-Plus special-pathogen-free animal facility-ben helyezték el. Ezekben az egerekben az SLE autoantitesteket a korábban leírtaknak megfelelően indukálták63. Röviden, a 6-8 hetes hím egerek 100 µL i.v. ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA) injekciókat kaptak, majd 24 órával később egy 100 µL i.v. lipopoliszacharid injekció (LPS az E. coli-ból, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Ezeket az injekciókat 2 és 4 hét után ismételték meg összesen három oltási fordulóban, az egereket pedig 48 órával a harmadik immunizálás után. C57bl / 6 J egerek injektált i.v. a PBS ugyanabban az ütemtervben használták, mint a kontrollok.
etika
a teljes vizsgálat során vérmintákat kaptak a betegek beleegyezése alapján. Az ebben a tanulmányban bemutatott összes módszert az emberi és a Murin donorok vonatkozó iránymutatásainak és előírásainak megfelelően hajtották végre.,
mitokondrium isolation
a mitokondriumokat a c57bl/6 J egerek májából izolálták a közzétett protocolok61,62 kombinációját követően. Az egereket nyaki diszlokáció áldozta fel, a májat gyorsan eltávolították, az epehólyagot kivágták, a májat jéghideg PBS-ben öblítették (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., A máj, majd a darált át egy előre lehűtött üveg/Teflon szövet daráló tartalmazó 12 mL jéghideg mitokondriális elszigeteltség pufferben (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM szacharóz) grammonként a májban akkor a földre, míg egy homogén felfüggesztést kapott. Az ép sejteket és a magokat 700 g, 4 °C, 10 perc alatt kétszer pelletálták. A szennyező membránokat, fehérjéket és organellákat 7000 g, 4 °C, 10 perc sebességgel két centrifugálással eliminálták, majd 10 000 g, 4 °C, 10 perc centrifugálással., A nyers mitokondriális szuszpenziót további extracentrifugálással tisztítottuk Perkoll gradienssel (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% V:V Perkoll) szemben 95 000 g, 4 °C, 30 perc alatt. A mitokondriumokat tartalmazó zenekart PBS-ben gyűjtötték össze. Hasonló megközelítést alkalmaztak az emberi mitokondriumok izolálására, azzal a kivétellel, hogy legfeljebb 107 Hep-G2 sejtet lizáltak ismételt átjárókkal egy keskeny nyomtávú tűn keresztül., A QIAGEN Qproteome (QIAGEN, Hilden, Németország) kereskedelmi készletet a gyártó utasításait követve a mitokondriumok hep-G2 sejtekből történő izolálására is használták a Western blotting által a fent említett protokollal történő minőségi összehasonlításhoz. Az izolált mitokondriumokat a BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA) segítségével a bicinchoninsav (BCA) módszerrel adagolták. Frissen izolált mitokondriumokat alkalmaztak minden kísérletben, kivéve azokat a szubmitokondriális részecskéket, amelyekre a pelletált mitokondriumokat -80 °C-on tartották, amíg szükséges.,
Submitokondriális részecskék (SMP) készítmény
SMP a máshol leírtak szerint készült60. Röviden, A fagyasztott mitokondriumokat szobahőmérsékleten felolvasztották, és 10 mg mitokondriális fehérjére hígították 10 mM-es 4-Morfolinepropaneszulfonsavban (MOPS). A mintákat ezután egy Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) segítségével szonikálták 20% maximális kimenettel 20 másodpercig, majd 10 percig sós-jeges vízfürdőn tartották. Ezt a ciklust kilenc alkalommal ismételték meg., A mintákat ezután 16 000 g, 4 °C, 10 perc alatt centrifugálták, hogy a töretlen mitokondriumokat és más nem kívánt törmeléket eldobják. A szupernóvánsokat egy friss csőben gyűjtötték össze, térfogatukat 2 mL-re, 10 mM-es MOP-ban állították be. A mintákat ezután 150 000 g-on, 4 °C-on 45 percig ultracentrifikálták. A pelletált SMP-t SMP pufferben (225 mM mannit, 75 mM szacharóz, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) reszuszpendálták és adagolták. Az SMP készítményeket -80 °C-on tartották, amíg szükséges.,
Vörös vérsejtek microparticles (RBCMP) készítmény
Vörös vérsejtek (RBC) különítve a vér az egészséges emberi önkéntesek centrifugálással 282 g 10 percig RT. Vérlemezkében gazdag plazma, valamint véralvadék deportáltak, valamint az RBC-frakció tartani. Az RBC-t megszámolták (Cellométer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA), és 5 × 108 sejt/mL koncentrációra állították be a Tyrode pufferében (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM glükóz, 10 mM HEPES, pH 7,4)., A 109 sejtet ezután 45 mL kettős desztillált vízben hígítottuk, majd 5 percig inkubáltuk. A puffer tónusát ezután 5 ml PBS 10x hozzáadásával egyensúlyba hoztuk (0,22 µm membránon szűrtük). A maradék RBC-t 1300 g-os centrifugálással távolítottuk el 5 percig RT-n, a felülúszót pedig 18 000 g-on 90 percig centrifugáltuk 18 °C-on. A fehérje koncentrációját BCA-vizsgálattal mértük.,
Western blotting
mitokondriális méret mérés dinamikus fényszórással (DLS)
az izolált mitokondriumok méretét DLS-vel mértük, egy zetasizer Nano ZS eszközzel (Malvern instruments, Malvern, UK), amely a standard 4 mW, 633 nm He-Ne lézerrel fényforrásként volt felszerelve, 173° – os érzékelési szögben. A kísérleteket háromszor megismételték 1 cm hosszú eldobható UV-Küvettákban (Brand GMBH, Wertheim, Németország), amelyek 100 µL izolált Murin mitokondriumot tartalmaznak PBS-ben hígítva 10 µg fehérje/µL koncentrációban., Az alábbi paraméterek figyelembe vették fel méretének mérése a mitokondriális: törésmutató az oldószer: 1.330, viszkozitása a minta: 0.8872 mPas, törésmutató, a fehérjék: 1.45, hőmérséklet: 25 °C.
Elektronmikroszkópos
Mitokondriumok (108) rögzítették a 3,5% – os acrolein 15 percig szobahőmérsékleten. A rögzített mintákat kétszer PBS-ben öblítették, majd 4% agarózba ágyazták. Az 50 µm-es metszeteket vibratómával vágták le, 1% ozmium-tetroxiddal 30 percig rögzítették, majd Durcupan gyantába ágyazták., A hetven nanométeres ultravékony szakaszokat 80 kV-on ábrázolták egy Tecnai G2 Spirit BioTWIN (Fei, Hillsboro, vagy, USA) átviteli elektronmikroszkóp segítségével.
Értékelése a mitokondriális oxigén fogyasztás
Mitokondrium újraszuszpendált a mitokondriális assay megoldás (MAS: 70 mM, szacharóz -, 220 mM-mannit, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA, illetve 0,2% – os(w/v) zsírsav-ingyenes BSA, pH 7.4 37 °C), kiegészítve 10 mM piruvát, 2 mM-maláttal 4 µM FCCP , pH 7.4. Az XF-96 lemezeken (Agilent, Santa Clara, CA, USA) 10 µg fehérjével egyenértékű fehérjét vetettek be., A lemezeket ezután 2000 g-ra centrifugáltuk 20 percig 4 °C-on.a mitokondriumok eloszlását fényes mező mikroszkóp alatt vizualizáltuk, hogy biztosítsuk a tapadást és a homogén repartitiót. A lemezeket a berakodás előtt körülbelül 40 percig 37 °C-on, CO2 nélkül tartották. Az oxigénfogyasztási arányt (OCR) a gyártó utasításainak megfelelően mértük (Agilent/Seahorse Bioscience). A kísérleteket három kútban replikálták, és minden kísérleti állapotra átlagolták., Összesen 3 mérést az oxigén fogyasztás minden feltétel készült, körülbelül minden 6 perc alatt bazális feltételek után szekvenciális kívül a rotenone (2 µM), szukcinát (10 mM), antimycin Egy (40 µM), valamint TMPD (N,N,N’,N’-tetrametil-p-diamint tartalmaz)/Aszkorbát (100 µM/10 mM). A szukcinátot a komplex II, a rotenon mint komplex I inhibitor, az antimicin a komplex III inhibitor elektrondonoraként alkalmazták, a légzést pedig a komplex IV-en keresztül mértük TMPD/aszkorbát alkalmazásával.,
Magas érzékenység citometria
kis méretük Miatt, mitokondrium által észlelt magas érzékenység citometria segítségével egy “kis részecske lehetőség”, amely egy előre scatter (FSC), amelyhez egy fotoelektron-cső (RÉSZLET) szerelt BD FACS Canto II Különleges Érdekében Kutatási Termék (SORP, BD Biosciences). A mitokondriumok (0.5 mg) volt foltos, 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (klón IC9-2, Sigma-Aldrich), 1 µM mitotracker mély piros (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 30 percig 37 °C hígított PBS végső mennyisége 500 µl előtt citometria elemzés., A mitokondriumok számának mennyiségi mérésére 3 µm átmérőjű polisztirol mikroszférát használtunk (Polysciences, PA, USA). Minden mintához 80 000 mikrogömböt adtak, és 500 mikrogömböt szereztek be. A szilícium-dioxid-részecskéket (Kisker Biotech, Steinfurt, Németország) 100-1000 nm-es méretskála meghatározására használták.
Mitokondriális DNS extrakció lúgos lízis
Elszigetelt mitokondrium pellet 10.000 g, 4 °C-on, 10 percig, majd újraszuszpendált 0.8 mL mtDNA elszigeteltség puffer Egy minden 3 mg mitokondriális fehérjék., A mitokondriumokat ezután egy térfogatban (v: v) lizálták mtDNS izolációs puffer B (extemporálisan elkészítve. 0,2 M NaOH, 1% SDS) 3 percig. jégen, enyhe agitáció alatt. az mtDNA szuszpenziókat egy térfogatú (v:v) mtDNA izolációs pufferrel semlegesítettük C (1, 32 M kálium-acetát, 4, 8 pH jéghideg ecetsavval beállítva) 5 percig. jégen, enyhe agitáció alatt. A mitokondriális törmeléket centrifugálással 10 percig, 14 000 g-on, RT. a Szupernatánsokat friss csövekbe szállították. az mtDNS-t egy éjszakán át -20 °C-on kicsapták 0-mal.,1 térfogat (v:v) kálium-acetát (törzsoldat: 3 M nátrium-acetát, pH-ja jéghideg ecetsavval 5,2-re állítható) és 0,7 térfogat (v:v) abszolút izopropanol. az mtDNS-t ezután 14 000 g-ra pelletálták, majd 1,5 mL 70% etanollal háromszor megmossák, majd reszuszpendálták DNS reszuszpenziós pufferben (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). A mitokondriális DNS-koncentrációt spektrofotometriával (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific) határoztuk meg.
az egér hepatocitáiból izolált magok
a magokat egérmájból izolálták a közzétett módszerekkel86., Röviden, a mitokondriumok izolációs protokolljai során, míg a mitokondriumok izolálására szupernatánsokat alkalmaztak, az első 700 g centrifugálásból származó pelleteket 10 mL jéghideg magok izolációs pufferében reszuszpendáltuk (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM szacharóz. pH 7.4), majd előhűtött üveg/Teflon Szövet darálóban őröljük. A felfüggesztést tovább rontotta három átjáró egy 25 G5 / 8 nyomtávú tűn keresztül, majd két átjáró egy 27 g ½ nyomtávú tűn keresztül., A szuszpenziót ezután egy 40 µM-es nejloncellás szűrővel (Thermo Fisher Scientific) szűrtük, majd 600 g, 4 °C, 10 perc sebességgel centrifugáltuk. A pelleteket 14 mL a pufferben reszuszpendálták, és 600 g, 4 °C, 10 perc sebességgel centrifugálták. A pelleteket ezután 9 térfogatnyi jéghideg magizolációs pufferben (1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2,0 M szacharóz) reszuszpendálták. pH 7,4), és 16 000 g, 4 °C, 30 perc centrifugálással. A pelleteket 200 µL PBS-ben reszuszpendálták, és -20 °C-on tárolták.,
teljes sejt-és nukleáris DNS-izoláció
a 25 mg teljes egérmájból vagy a 200 µL-es vagy izolált magokból származó DNS-t qiamp® DNA Mini Kit (QIAgen) segítségével nyerték ki, a gyártó utasításait követve. A mintákat DNS-reszuszpenziós pufferben eluálták.,
mitokondriális DNS és nukleáris DNS gazdagítja qPCR
harminc nanogramm mitokondriális DNS-t, nukleáris DNS-t vagy ugyanolyan mennyiségű teljes DNS-t, amelyet az egész egérmájból a fent említett protokollok segítségével extraháltak, egy Rotor-gén Q valós idejű qPCR cycler (QIAgen) – ben erősítették meg az Ssoadvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) standard protokollok szerint 10 µL reakció térfogatban., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
mitokondriális DNS emésztés restrikciós enzimekkel
a tisztított egér mtDNS-t a Hae II vagy a PST I restrikciós endonukleázok (NEB, Whitby, ON, Kanada) emésztették a gyártó protokollja szerint. Az emésztett termékeket (1, 5 µg) ezután 0, 5% (w/v) agaróz gélen oldották meg. A képeket egy Chemidoc MP Gel dokumentációs rendszeren (Bio-Rad) szerezték be. A teljes hosszúságú gélt a kiegészítő ábra mutatja be. 6d.,
S1 nuclease kezelés a mitokondriális DNS-t, valamint a nukleáris DNS
30 µg mtDNA, valamint nDNA volt hígított 200 µL 1X S1-puffer kezelt 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Tudományos) 5 percig 37 °C-on Reakció volt, megállította a kiegészítéssel, 600 mM EDTA (végső koncentráció), valamint inkubációs 70 °C-on 10 percig. A mintákat 300 mM-es nátrium-acetát (végső koncentráció) és 2 térfogat (v:v) abszolút etanol hozzáadásával -20 °C-on 16 órán keresztül kicsapták., A mintákat 14 000 g, RT, 20 perc alatt pelletálták, majd 1 mL 70% etanolt mostak, és DNS-reszuszpenziós pufferben reszuszpendálták. A versenyvizsgálatok esetében a kezeletlen nDNA és mtDNA ugyanazt a kezelést követte az enzim hozzáadása nélkül. A mintákat a qPCR adagolta.
A mitokondriumok in vitro oxidációját
az adagolt mitokondriumokat 1,5 mg mitokondriális fehérje / mL koncentrációban, 500 µM terbutil-hidroperoxid (Tbhp) (Sigma-Aldrich) oxidálószert tartalmazó PBS-ben pelletálták és reszuszpendálták., A mitokondriumokat 1 óra 30 percig 37 °C-on, enyhe keverés közben oxidáltuk, majd kétszer jéghideg PBS-vel öblítettük. Az oxidált mitokondriumokat később a BCA számszerűsítette.
mitokondriális lipid oxidáció
Tiobarbitursav reaktív anyagok (TBARS) képződését a Tbars paraméterkészlet (R&d systems, Minneapolis, MN, USA) segítségével értékelték a gyártó utasításait követve. Kétszáz mikrogramm mitokondriumot lizáltak, a fehérjéket triklór-ecetsavval (TCA) kicsapták, majd 12 000 g-ra, szobahőmérsékleten 4 percig pelletálták., A szupernatánsokat friss csövekbe helyezték át. A mintákat (75 µL) 37,5 µL tiobarbitursavval inkubáltuk egy 96-kútlemezben, 3 órán át 50 °C-on.az Abszorpciókat 532 nm-en olvastuk egy SpectraMax 190 mikrolemez-olvasón (molekuláris eszközök, Sunnyvale, CA, USA), és a Tbars számszerűsítését a készletben található szabványos görbe segítségével végezték el. Az oxidált mintákat összehasonlítottuk a mitokondriumok szabályozásával, amelyeket ugyanolyan körülmények között inkubáltunk a TBHP-mentes PBS-ben.,
mitokondriális fehérje oxidáció
az in vitro mitokondriális oxidációt követő karbonil-motionok képződését a gyártó utasításait követve a protein Carbonyl Content Assay Kit (Sigma Aldrich) segítségével mértük. Az oxidált mintákat összehasonlítottuk a mitokondriumok szabályozásával, amelyeket ugyanolyan körülmények között inkubáltunk a TBHP-mentes PBS-ben.,
antitestek Kimutatása célzás mitokondriális epitopes ELISA módszerrel
a kimutatása anti-egész mitokondriális antitestek (AwMA), egér mitokondrium hígított (500 µg/mL) 50 mM-karbonát/bikarbonát puffer, pH 9.6, majd 25 µL per nos tele volt rá 96-hát félig-területet lapos alsó polisztirol nagy erejű microplates (Corning, New York, USA). A lemezeket 4 °C-on 18 órán át bevonták, majd 37 °C-on 4 órán át blokkolták 10% FBS-t és 0,5% zselatint tartalmazó PBS-vel. Miután három mosás PBS, sera hígított 1: 150 (eltérő rendelkezés hiányában) a PBS-10% FBS-0.,3% zselatint inkubáltunk egy éjszakán át 4 °C-on két példányban. Három PBS-vel végzett mosás után a lemezeket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk alkalikus foszfatáz – (AP) konjugált kecske anti-egérrel vagy anti-humán IgG-vel (Sigma-Aldrich), 1:1,000 hígítva PBS-0,4% szarvasmarha szérum albuminban (BSA). A lemezeket háromszor PBS-vel mostuk, és 37 °C-on ~30 percig p-nitrofenol-foszfáttal (P-NPP) fejlesztettük ki, az optikai sűrűséget (OD) pedig 405 nm-en olvastuk egy mikrolemez-olvasón., Ugyanezt a protokollt alkalmazták a szubmitokondriális részecskéket célzó autoantitestek kimutatására, 50 mM-es karbonát/bikarbonát pufferben hígított SMP-kútonként 25 µL-rel (50 µg/mL), 9,6 pH-val. Hasonló megközelítést alkalmaztak a humán mitokondriumok esetében a következő módosítással:a lemezeket torma-peroxidáz-konjugált anti-humán IgG másodlagos antitesttel (1: 3,000) inkubáltuk, a peroxidáz aktivitást szobahőmérsékleten ~5 percig 3,3′,5,5′ – tetrametilbenzidinnel (TMB) tártuk fel. A reakciót 2 N H2SO4-gyel, az ODs-t pedig 450 nm-rel állították le., Az anti-mtDNA ELISA esetében a lemezeket 1%-os protamin-szulfáttal előmelegítették két desztillált vízben 1 órán át szobahőmérsékleten. A lemezeket háromszor PBS-vel mostuk, és egy éjszakán át 4 °C-on, 400 ng mtDNA-val PBS-ben bevonva. Minden további lépés azonos volt az AwMA-ELISAs esetében alkalmazott lépésekkel. Az üres értékeket (mitokondriális antigének és szérumok nélkül) minden egyes beteg esetében a mért értékekből alkották. Ezeknek a vizsgálatoknak a kidolgozása során a kutak megfelelő bevonatát izotípushoz illeszkedő egér monoklonális antitestek (MAB) alkalmazásával tesztelték. Monoklonális antitest (klón IV.,3, 4 µg/mL) minden esetben negatív vizsgálati kontrollként alkalmazták, míg a bevonó antigénektől függően különböző monoklonális antitesteket alkalmaztak pozitív vizsgálati kontrollként: anti-TOMM22 mAb (Ic9-2 klón, 4 µg / mL. Abcam) az intakt mitokondriumok, egy anti-DNS mAb (klón 35I9 DNS, 10 µg / mL. Abcam) vagy citokróm C mAb (klón 7H8.2C12, 5 µg / mL. BD Biosciences).,
Versenyvizsgálat
az AwMA-ELISAs-t az előző szakaszokban leírtak szerint, a következő módosításokkal végezték el: a szérummintákat a versenytársak (azaz a mitokondriumok vagy a vörösvértestek mikrorészecskéi) különböző koncentrációival (0, 25, 1 és 3 mg / mL) előre inkubálták hígító pufferben (1:150). az adatokat az egyes versenyeket követően megmaradó jel százalékában mutatjuk be, összehasonlítva a versenytársak hiányában mért OD-val (405 nm).,
hasonló eljárást alkalmaztak az AmtDNA-ELISA-val szemben, a Versengő DNS (magokból vagy mitokondriumokból extrahált, S1 nukleázkezeléssel vagy anélkül végzett) koncentrációjának (0, 3, 9 és 27 ng/µL) növelésével.
statisztikák
a csoportok közötti összehasonlításokat a hallgatói T-teszt, a Wilcoxon teszt, a Friedman vagy a Kruskal-Wallis tesztek, az egyirányú ANOVA, a kétirányú vagy ismételt intézkedések segítségével végezték el ANOVA az eredménytől függően, valamint a csoportok számát és típusát., Több összehasonlításnál megfelelő post-hoc korrekciós teszteket alkalmaztak, mint például a Dunn, a Dunnett, a Sidak vagy a Bonferroni. az AwMA, az AmtDNA és az anti-HSP60 közötti összefüggéseket Spearman korrelációkkal számították ki. Ezeknek az antitesteknek az ACA eredmények szerinti eloszlását Wilcoxon teszttel hasonlították össze. Az AwMA vagy az AmtDNA közötti összefüggéseket és a klinikai eredményeket a bivariate és a többváltozós lineáris és logisztikai regressziók tanulmányozták., Klinikai eredmények tanult átlagos intima media vastagság, százalékos változás az áramlás-mediált dilatáció (FMD) a brachialis artéria, jelenléte FMD, jelenléte emléktábla a nyaki, trombotikus eseményt valaha, fehérvérsejt, vérlemezkeszám, fokozott DNS-kötő által Farr assay fenti normál tartomány a vizsgálati laboratórium, jelenléte kárt szerint SLICC Kárt Index (SDI > 0), nagy aktivitás szerint SLEDAI-2K tevékenység pontszám (SLEDAI ≥ 4), jelenléte a lupus nephritis, biopszia osztály, valamint segít majd aktivitási index a biopszia., Ez utóbbiakat a betegség időtartamára, életkorára, testtömeg-indexére (BMI), alacsony sűrűségű lipoproteinekre (LDL) koleszterinre, maláriaellenes gyógyszerekre és prednizonra igazították. A logisztikus regressziók páratlan arányokkal és 95% – os Wald-konfidencia intervallummal vannak ellátva. A résztvevők eredményei pozitívnak bizonyultak az AwMA és az AmtDNA esetében, amikor értékük meghaladta a youden indexének maximalizálása után azonosított cut-off értéket. A levágáshoz 95% – os konfidencia intervallumot kaptunk 10 000 bootstrap minta felhasználásával. A teljesítményméréseket 95% – os pontos konfidencia intervallummal mutatják be.,
Software
A Western blot képeket az 5.2 (LI-COR biotechnology) Képstúdió segítségével szerezték be. mtDNA migráció agaróz gélen keresztül imaged segítségével Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). A DLS vizsgálatokat a beépített Zetasizer 7.10 szoftver (Malvern Instruments) segítségével végezték. Az EM képeket a 601.384 képrögzítő szoftverrel szerezték be (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). Az áramlási citometriát a BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences) segítségével végezték. A DNS-izolációkból származó hozamokat az ND-1000 3.8 segítségével számszerűsítették.,1 szoftvert (Thermo Fisher Scientific) és qPCR-t végeztek a RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen) segítségével. Az optikai sűrűséget a SoftMax Pro 5.4.1 (molekuláris eszközök)segítségével mértük. A számokat az ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) és a Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). A statisztikai elemzéseket a Prism 7 szoftverrel (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) és SAS változat 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).