PMC (Čeština)
Diskuse
je důležité, aby se týkají genové variace klinických fenotypů pomocí správné fenotypizační nástroje aktivity CYP3A4. 3-hydroxylace chinin bylo prokázáno jako biomarker reakce na aktivitu CYP3A4, protože 3-hydroxylace chinin je katalyzována pomocí CYP3A4 in vivo a in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Proto byly v této studii použity kinetické parametry enzymatické katalýzy na chinin 3-hydroxylaci jako míra aktivity CYP3A4.
dvacet tři rekombinantních HOLOENZYMŮ CYP3A4 vykazovalo významně pokles Clintu směrem k chininu. Šest variant, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 posunovými), a CYP3A4*21 (Y319C), vykazovaly mnohem nižší CLint pro chinin (1.44–5.80%, Tabulka 2), než wild-type CYP3A4*1A., Pokud naše in vitro zjištění jsou replikovány v klinických studiích, pacientů, kteří jsou nositeli těchto alel může být potenciálně CYP3A4 chudé-metabolismem a může: i) vyžadují nižší chinin dávky k dosažení terapeutické koncentrace v plazmě; a ii) být zvýšené riziko nežádoucích účinků a toxicity při konvenčních dávkách chininu jsou používány.
CYP3A4*2 (S222P) vykazovali sníženou CLint více než šestinásobně (14.76%, Tabulka 2) na chinin ve srovnání s wild-type CYP3A4*1A., Toto snížení enzymatické aktivity může být proto, že serin→prolin aminokyseliny substituční by mohlo způsobit významné změny v trojrozměrné struktury enzymu (prolin je známo, že zlomit alfa-šroubovice). Podobně bylo hlášeno, že CYP3A4 * 2 má nižší CLint pro midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipin (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018) a lidokain (Fang et al., 2017), než enzym divokého typu. Naproti tomu CYP3A4 * 2 vykazoval vyšší CLint pro amiodaron (Yang et al., 2019)., Pro testosteron měl CYP3A4 * 2 sníženou vnitřní clearance, pokud byla vyjádřena pomocí expresního systému Escherichia coli in vitro (Miyazaki et al., 2008), ale aktivita byla srovnatelná s enzymem divokého typu, když byl exprimován v baculovirovém expresním systému (Sata et al., 2000) (Tabulka 3).
CYP3A4 * 3 (M445T) vykazoval nižší enzymatickou aktivitu vůči chininu ve srovnání s alelou divokého typu (tabulka 2)., Amino-kyseliny zbytky 445 se nachází v zachovaných heme-binding region, jen dvě aminokyseliny C-svorky k absolutně zachované Cys na pozici 442 CYP3A4 bílkovin (Sata et al., 2000); změna Met445Thr proto může mít nepříznivý účinek na vazbu hemu, což vede ke změně katalytické aktivity enzymu, zejména při vazbě vhodného substrátu. Jak je však uvedeno v tabulce 3, enzymatická aktivita CYP3A4*3 byla podobná enzymatické aktivitě divokého typu CYP3A4 u většiny testovaných substrátů., Nesoulad výsledků může vyplynout z různých použitých heterologních expresních metod a vzhledem k rozdílné specifičnosti substrátu pro variantu.
CYP3A4*4 (I118V) vykazovaly nižší CLint vůči chininu, oproti wild-type CYP3A4*1A. Studie site-directed mutageneze naznačují, že ser119 je klíčová aminokyselina, podílí jako aktivní místě reziduí (Yano et al., 2004). Proto mutace Ile118Val pravděpodobně ovlivní konformaci aktivního místa, což má za následek sníženou katalytickou aktivitu., Stejně tak in vivo studie ukázala, že poměr močových úroveň 6β-hydroxycortisol/volný kortizol v těchto heterozygotních jedinců je nižší než u zdravých kontrol, což naznačuje snížené enzymatické aktivity (Hsieh et al., 2001).
obě varianty CYP3A4*8 a *13 vykazovaly detekovatelné, i když nižší hladiny holoproteinů CYP3A4 a měly extrémně nízké katalytické aktivity vůči chininu. Na rozdíl od našich výsledků bylo hlášeno, že CYP3A4*8 a *13 nevykazují žádné detekovatelné CYP holoproteiny, pokud jsou vyjádřeny v bakteriálních systémech (Eiselt et al., 2001)., Spekulujeme, že použití bakteriálních vs. hmyzích expresních systémů může vysvětlit různé výsledky. Bakteriální exprese systém postrádá intracelulární membrány prostředí (Gonzalez a Korzekwa, 1995) potřebné pro vysokou expresi proteinu. V kontrastu, hmyzí buňky mohou zpracovat a upravit proteiny podobným způsobem jako lidské buňky, umožňující správné skládání enzymu a začlenění hem kofaktorem, což vede k vyšší expresi CYP3A4 proteiny.,
CYP3A4*11 (T363M) vyjádřil na výrazně nižší úroveň, než wild-type CYP3A4 (Obrázek 2), zjištění, že je v souladu se studiemi pomocí bakteriální a savčí expresní systémy (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Threonin ve zbytku 363 v místě rozpoznávání substrátu (SRS)-5 může přispět k tvorbě vodíkové vazebné sítě. Substituce z threoninu na methionin může vést ke ztrátě katalytické aktivity (Murayama et al., 2002). Takže CYP3A4 * 11 vykazoval sníženou chininovou hydroxylační aktivitu v současné studii., Kromě toho CYP3A4 * 11 vykazoval sníženou aktivitu hydroxylace testosteronu (Murayama et al., 2002), výrazně zvýšil přilnavost k lidokainu (Fang et al., 2017) a amiodaron (Yang et al., 2019), ale nebyl spojen s výraznými změnami metabolických aktivit pro ibrutinib (Xu et al., 2018) (tabulka 3).
CYP3A4*12 (L373F), zobrazí se dramaticky snížil CLint vůči chininu, podobně jako s předchozí výsledek výzkumu k midazolamu (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12 má amino-kyseliny změna Leu373Phe; mutovaných reziduí se nachází v blízkosti Arg-372 a Glu-374, které se účastní vzniku vodíkové-lepení sítě a jsou zapojeny do aktivních míst podle studie zahrnující site-directed mutageneze (Yano et al., 2004). Mutační zbytek (L373F) tedy pravděpodobně ovlivní stabilitu vodíkové vazebné sítě a prostorovou konformaci dutiny aktivního místa, což má za následek změněnou katalytickou aktivitu CYP3A4*12.,
CYP3A4*20 (488 posunovými) ukázala pozoruhodně zmenšil apoprotein vyjádření (Obrázek 1) a výrazně snižuje CLint vůči chininu. Naproti tomu nebyly hlášeny žádné katalytické aktivity midazolamu 1′- a 4-hydroxylace u kvasinek nebo HEK 293 mikrosomů exprimujících CYP3A4*20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Tyto protichůdné výsledky mohou být způsobeny různými heterologní expresní systémy a substráty použité v experimentech. Kromě toho bylo hlášeno, že heterozygot CYP3A4*20 identifikovaný u brazilských jedinců vykazuje sníženou systémovou clearance ∼1.,9-krát pro midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Dříve se předpokládalo, že tato vzácná mutace může ovlivnit skládání bílkovin, inkorporaci hemu (Westlind-Johnsson et al., 2006) a prostorová konformace dutiny aktivního místa, což vede ke snížení nebo ztrátě katalytické aktivity spojené s použitým substrátem.
CYP3A4 * 21 (Y319C), který byl identifikován v čínské populaci (Zhou et al., 2011), vykazovala slabou katalytickou aktivitu vůči chininu v naší studii. Zajímavé je, že v našich výsledcích nebyla zjištěna žádná detekovatelná exprese apoenzymu., Tyr319 je vysoce konzervované reziduum v cytochromu P450 rodiny po celé eukaryota vývoj od hlístů na člověka (Zhou et al., 2011). Podle In silico funkčních předpovědí (Zhou et al., 2011), tyr319 zbytek leží na důležité doméně a nahrazení Tyr Cys v poloze 319 proteinu CYP3A4*21 může vyvolat dramatické změny v konfiguraci dutiny v aktivním místě. Proto může CYP3A4 * 21 produkovat nefunkční protein se sníženou katalytickou aktivitou vůči chininu., Dále jsme spekulovali, že tyto protilátky, které jsme použili k detekci rekombinantních apoproteinů CYP3A4, nemusí být vhodné pro detekci varianty CYP3A4*21. To znamená, že mutace Tyr319Cys v CYP3A4*21 může zabránit tomu, aby tyto protilátky rozpoznaly specifické epitopy v CYP3A4.
naproti tomu dva z rekombinantních holoenzymů CYP3A4, CYP3A4*15 (R162Q) a CYP3A4*29 (F113I) vykazovaly významně zvýšený CLint pro chinin. Podobně CYP3A4*15 i CYP3A4*29 vykazovaly zvýšenou přilnavost k lidokainu (Fang et al., 2017), ale ukázal pokles CLint pro ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 byl detekován nejprve v různých etnických populacích s malými vzorky pro každou etnickou skupinu (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 byl identifikován a pojmenován v naší nedávné studii (Hu et al., 2017). Obě varianty souvisejí s rychlým metabolizmem chininu in vitro. Pokud potvrzení zvýšené chinin clearance je nalézt u jedinců, kteří jsou homozygotní nebo heterozygotní přenašeči CYP3A4*29 nebo CYP3A4*15, tito jedinci mohou být CYP3A4 ultra-rychlým metabolismem chininu., Pacienti s těmito genotypy mohou: i) mít horší terapeutickou účinnost, pokud jsou podávány obvyklé klinické dávky chininu; a ii) vyžadují vyšší dávky k dosažení terapeutických plazmatických koncentrací.
Žádný aktivní holoenzymes CYP3A4*6 (277 posunovými), CYP3A4*26 (R268Stop), a CYP3A4*30 (R130Stop) varianty byly zjištěny, a proto, že vystavoval žádné metabolické aktivity na chinin (Tabulka 2).,
CYP3A4*6 má vložení adenin reziduí v exonu 9 (830-831 insA); tato mutace způsobuje posunovými a vede k překladu zkrácený protein, který nelze začlenit hemu (Hsieh et al., 2001). V důsledku toho nebyla v naší studii zjištěna katalytická aktivita CYP3A4*6 vůči chininu. Jak je uvedeno dříve in vivo, Číňan byl zjištěn heterozygotní pro CYP3A4*6 s mnohem nižší poměr močových úroveň 6β-hydroxycortisol:volný kortizol, než wild-type jedinců, což naznačuje, že se snížil aktivitu CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., Podobně, pacient, který je heterozygotní pro CYP3A4*6, podstupujících transplantaci orgánů, měl takrolimus koncentrace-dávka upravená poměr 4.3-krát vyšší než u wild-type pacientů (Jun et al., 2009).
CYP3A4*26 má substituci C→T nukleotidu v exonu 5. To způsobí, že změna z argininu k předčasnému stop kodonu na pozici 268, a výsledky v domnělé zkrácený protein postrádá katalytickou doménu, a proto činnost (Werk et al., 2014)., CYP3A4 * 26 nemusí být vyjádřen kvůli předčasnému zastavení kodonu v poloze 268 nebo pokud ano, může být protein označen pro rychlou degradaci (Werk et al., 2014). Proto jsme nebyli schopni detekovat holoprotein varianty CYP3A4*26 vyjádřené v buňkách Sf21. Podobně, 19-rok-starý ledvin transplantovaných pacientů, identifikovaných jako homozygotní pro CYP3A4*26 a mezitím také homozygotní pro CYP3A5*3, projevil nečekaně vysoké plazmatické hladiny takrolimu v důsledku extrémně snížena clearance takrolimu (Werk et al., 2014).,
podobně jako CYP3A4*26, CYP3A4*30 má změnu z argininu na předčasný stop kodon v poloze 130 (Hu et al., 2017). Arg130 je považován za důležitý pro začlenění hemu (Eiselt et al., 2001) a tím mutace Arg130 by narušila inkorporaci hemu a ovlivnila tak holoenzymovou expresi CYP3A4.
v kombinaci s předchozími studiemi (Tabulka 3) ukázaly některé alelické varianty CYP3A4 různé preference substrátů na rozdíl od enzymů divokého typu. Některé varianty totiž vykazují změněné katalytické aktivity s profilem závislým na substrátu., Jak je uvedeno výše, rozporuplné výsledky vyplývající z určitého substrátu ve studiích, mohou nastat z mnoha faktorů, jako jsou rozdíly od in vitro nebo in vivo metody a různé heterologní expresní systémy.
chinin má časté nežádoucí účinky kvůli úzkému terapeutickému indexu (Bateman a Dyson, 1986). Tyto nežádoucí účinky nebyly vyvolány pouze léky; byly také způsobeny běžnými nápoji obsahujícími chinin., Na základě systematického přezkumu klinických údajů ze sto čtrnácti článků tvořily nežádoucí účinky, které byly výsledkem nápojů obsahujících chinin, 20% celkových nežádoucích účinků na chinin (Liles et al., 2016). Překvapivě, i při minutové expozici běžných nápojů, někteří jedinci zaznamenali závažné nežádoucí účinky zahrnující více orgánových systémů. Vzhledem k zřejmé interindividuální rozmanitost v chinin citlivost, změny v CYP3A4 může být jeden z možných mechanismů hlubších chinin citlivé a nežádoucích účinků., Kromě toho, předpisy pro použití chininu nebyly stanoveny v některých zemích, jako pilulky obsahující 50 mg nebo méně chininu jsou považovány za přírodní zdravotní produkt a jsou k dispozici bez lékařského předpisu v Kanadě (Liles et al., 2016); pleťové vody a šampony obsahující chinin, stejně jako nápoje obsahující chinin, zůstávají běžně dostupné a není vyžadován dohled. Předpokládá se tedy, že je nezbytné zvýšit povědomí o interindividuálních rozdílech v citlivosti chininu a nežádoucích účincích na chinin u lékařů a veřejnosti.