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discusión
es importante relacionar las variaciones génicas con los fenotipos clínicos utilizando herramientas adecuadas de Fenotipado de la actividad de CYP3A4. Se ha demostrado que la 3-hidroxilación de la quinina es una reacción de biomarcadores para la actividad del CYP3A4 porque la 3-hidroxilación de la quinina es catalizada por el CYP3A4 tanto in vivo como in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Por lo tanto, los parámetros cinéticos de la catálisis enzimática en la hidroxilación de la quinina 3 fueron utilizados como medida de la actividad del CYP3A4 en el presente estudio.
veintitrés de las holoenzimas CYP3A4 recombinantes mostraron una disminución significativa del CLint hacia la quinina. Seis variantes, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift), y CYP3A4*21 (y319c), exhibieron un CLint mucho más bajo para la quinina (1,44–5,80%, Tabla 2) que el tipo salvaje CYP3A4*1A., Si nuestros hallazgos in vitro se replican en estudios clínicos, los pacientes que son portadores de estos alelos pueden ser potencialmente metabolizadores pobres del CYP3A4 y pueden: i) requerir dosis más bajas de quinina para alcanzar concentraciones plasmáticas terapéuticas; y ii) tener un mayor riesgo de efectos adversos y toxicidad cuando se utilizan dosis convencionales de quinina.
CYP3A4 * 2 (S222P) mostró un CLint reducido de más de seis veces (14,76%, Tabla 2) para la quinina en comparación con CYP3A4*1A de tipo natural., Esta disminución de la actividad enzimática podría deberse a que una sustitución de aminoácidos serina→prolina podría causar un cambio importante en la estructura tridimensional de la enzima (se sabe que la prolina rompe las hélices alfa). Del mismo modo, se ha informado que CYP3A4*2 posee un CLint más bajo para midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipine (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018), y lidocaína (Fang et al., 2017), que la de la enzima de tipo salvaje. En contraste, CYP3A4 * 2 mostró un CLint más alto para amiodarona (Yang et al., 2019)., Para la testosterona, CYP3A4 * 2 tuvo una disminución del aclaramiento intrínseco cuando se expresó usando el sistema Escherichia coli express in vitro (Miyazaki et al., 2008), pero la actividad fue comparable a la enzima de tipo salvaje cuando se expresa en el sistema de expresión de baculovirus (Sata et al., 2000) (cuadro 3).
CYP3A4 * 3 (M445T) mostró menor actividad enzimática hacia la quinina, en comparación con el alelo salvaje (Tabla 2)., El residuo de aminoácidos 445 se encuentra dentro de la región de unión Heme conservada, solo dos terminales C de aminoácidos al Cys absolutamente conservado en la posición 442 en la proteína CYP3A4 (Sata et al., 2000); por lo tanto, un cambio de Met445Thr puede ejercer un efecto desfavorable sobre la Unión del hemo, lo que resulta en una alteración en la actividad catalítica de la enzima, especialmente cuando se une a un sustrato adecuado. Pero como se señaló en la Tabla 3, la actividad enzimática de la enzima CYP3A4*3 fue similar a la del salvaje-tipo de CYP3A4 para la mayoría de los sustratos ensayados., La discrepancia de resultados podría surgir de diferentes métodos de expresión heteróloga utilizados, y debido a la especificidad de sustrato diferente para la variante.
el CYP3A4*4 (I118V) mostró un CLint más bajo hacia la quinina, en relación con el CYP3A4*1A de tipo silvestre. Los estudios de mutagénesis dirigida al sitio sugieren que el ser119 es un aminoácido clave implicado como residuo del sitio activo (yano et al., 2004). Por lo tanto, es probable que la mutación Ile118Val afecte la conformación del sitio activo, lo que resulta en una disminución de la actividad catalítica., De manera similar, un estudio in vivo mostró que la relación del nivel urinario de 6β-hidroxicortisol/cortisol libre en estos individuos heterocigotos fue menor que en los controles sanos, lo que sugiere una disminución de las actividades enzimáticas (Hsieh et al., 2001).
tanto las variantes CYP3A4*8 como *13 mostraron niveles detectables, aunque más bajos, de HOLOPROTEÍNAS CYP3A4 y tuvieron actividades catalíticas extremadamente bajas hacia la quinina. Contrariamente a nuestros resultados, se ha informado que CYP3A4*8 y *13 no muestran holoproteínas CYP detectables cuando se expresan en sistemas bacterianos (Eiselt et al., 2001)., Se especula que el uso de sistemas de expresión bacteriana vs. insecto puede explicar los diferentes resultados. El sistema de expresión bacteriana carece de un entorno de membrana intracelular (Gonzalez y Korzekwa, 1995) requerido para una alta expresión de proteínas. Por el contrario, las células de los insectos pueden procesar y modificar las proteínas de una manera similar a las células humanas, lo que permite el plegamiento adecuado de la enzima y la incorporación del cofactor hemo, lo que resulta en una mayor expresión de las proteínas CYP3A4.,
el CYP3A4 * 11 (T363M) se expresó en niveles significativamente más bajos que el CYP3A4 de tipo natural (figura 2), un hallazgo que es consistente con estudios que utilizan sistemas de expresión bacterianos o de mamíferos (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Treonina en el residuo 363 dentro del sitio de reconocimiento de sustrato (SRS)-5 puede contribuir a la formación de la red de enlace de hidrógeno. Una sustitución de treonina a metionina podría resultar en la pérdida de actividad catalítica (Murayama et al., 2002). Por lo tanto, CYP3A4 * 11 mostró una actividad de hidroxilación de quinina reducida en el estudio actual., Además, CYP3A4 * 11 mostró una actividad de hidroxilación de testosterona reducida (Murayama et al., 2002), había aumentado notablemente el CLint hacia la lidocaína (Fang et al., 2017) y amiodarona (Yang et al., 2019), pero no se asoció con cambios notables en las actividades metabólicas de ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tabla 3).
CYP3A4 * 12 (L373F) mostró una disminución drástica del CLint hacia la quinina, de manera similar con un resultado de investigación anterior hacia el midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4 * 12 posee un cambio de aminoácido de Leu373Phe; el residuo mutado se encuentra cerca de Arg-372 y Glu-374, que participan en la formación de una red de enlace de hidrógeno y están involucrados en sitios activos según estudios que involucran mutagénesis dirigida al sitio (Yano et al., 2004). Por lo tanto, es probable que el residuo mutacional (L373F) afecte la estabilidad de la red de enlace de hidrógeno y la conformación espacial de la cavidad del sitio activo, lo que resulta en una actividad catalítica alterada de CYP3A4*12.,
CYP3A4 * 20 (488 frameshift) mostró una notable disminución de la expresión de apoproteínas (Figura 1) y una reducción drástica del CLint hacia la quinina. En contraste, no se han reportado actividades catalíticas de midazolam 1′- y 4-hidroxilación en microsomas de levadura o HEK 293 que expresen CYP3A4 * 20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Estos resultados contradictorios pueden ser atribuibles a los diferentes sistemas de expresión heteróloga y sustratos utilizados en los experimentos. Además, se ha informado que un heterocigoto CYP3A4*20, identificado en individuos Brasileños, muestra un aclaramiento sistémico reducido de ∼1.,9 veces el midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Anteriormente se planteó la hipótesis de que esta rara mutación podría influir en el plegamiento de proteínas, la incorporación de hemo(Westlind-Johnsson et al., 2006), y la conformación espacial de la cavidad del sitio activo, dando lugar a una disminución o pérdida de la actividad catalítica asociada con el sustrato utilizado.
CYP3A4*21 (Y319C), que se identificó en la población China (Zhou et al., 2011), mostró una débil actividad catalítica hacia la quinina en nuestro estudio. Curiosamente, no se identificó ninguna expresión de apoenzima detectable en nuestros resultados., Tyr319 es un residuo altamente conservado en la familia del citocromo P450 a lo largo de la evolución eucariota de nematodo a humano (Zhou et al., 2011). De acuerdo con las predicciones funcionales in silico (Zhou et al., 2011), el residuo Tyr319 se encuentra en un dominio importante y una sustitución de Tyr con Cys en la posición 319 de la proteína CYP3A4*21 Puede inducir alteraciones dramáticas en la configuración de la cavidad del sitio activo. Por lo tanto, el CYP3A4*21 puede producir una proteína malfuncional con actividad catalítica reducida hacia la quinina., Además, especulamos que estos anticuerpos que utilizamos para detectar apoproteínas recombinantes CYP3A4 podrían no ser adecuados para detectar la variante CYP3A4 * 21. Es decir, la mutación de TYR319CYS en CYP3A4 * 21 puede impedir que estos anticuerpos reconozcan los epítopos específicos en CYP3A4.
por el contrario, dos de las holoenzimas recombinantes de CYP3A4, CYP3A4*15 (R162Q) y CYP3A4*29 (F113I), mostraron un aumento significativo del CLint para la quinina. De manera similar, tanto CYP3A4*15 como CYP3A4*29 mostraron un aumento de CLint hacia la lidocaína (Fang et al., 2017), pero mostró una disminución del CLint para ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 se detectó primero en diferentes poblaciones étnicas con pequeñas muestras para cada grupo étnico (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 fue identificado y nombrado en nuestro estudio reciente (Hu et al., 2017). Las dos variantes están relacionadas con el rápido metabolismo de la quinina in vitro. Si se encuentra confirmación de un aumento del aclaramiento de quinina en individuos que son portadores homocigotos o heterocigotos de CYP3A4*29 o CYP3A4*15, estos individuos pueden ser metabolizadores ultrarrápidos de la quinina por CYP3A4., Los pacientes con estos genotipos pueden: i) tener menor eficacia terapéutica cuando se administran dosis clínicas habituales de quinina; y ii) requerir dosis más altas para alcanzar concentraciones plasmáticas TERAPÉUTICAS.
no se detectaron holoenzimas activas de las variantes CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) y CYP3A4*30 (R130STOP) y, en consecuencia, no mostraron actividad metabólica con quinina (Tabla 2).,
CYP3A4 * 6 tiene una inserción de un residuo de adenina en el exón 9( 830-831 insA); esta mutación causa un cambio de marco y conduce a la traducción de una proteína truncada que no puede incorporar heme (Hsieh et al., 2001). En consecuencia, la actividad catalítica del CYP3A4*6 hacia la quinina no fue identificada en nuestro estudio. Como se mostró previamente in vivo, se encontró que una persona China era heterocigota para CYP3A4 * 6 con una proporción mucho menor de nivel urinario de 6β-hidroxicortisol:cortisol libre que los individuos de tipo silvestre, lo que sugiere una disminución de la actividad del CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., De manera similar, un paciente heterocigoto para CYP3A4*6, sometido a trasplante de órganos, tenía una relación de tacrolimus ajustada a la concentración de dosis 4,3 veces mayor que la de los pacientes de tipo natural (Jun et al., 2009).
CYP3A4 * 26 tiene una sustitución de nucleótidos C→T en el exón 5. Esto causa un cambio de arginina a un codón de parada prematuro en la posición 268, y resulta en una proteína putativa acortada que carece de dominio catalítico y, por lo tanto, de actividad (Werk et al., 2014)., CYP3A4 * 26 puede no expresarse debido al codón de parada prematuro en la posición 268 o si lo es, la proteína puede estar marcada para una rápida degradación (Werk et al., 2014). En consecuencia, no pudimos detectar la holoproteína de la variante CYP3A4 * 26 expresada en células Sf21. Asimismo, un paciente trasplantado de riñón de 19 años, identificado como homocigoto para CYP3A4 * 26 Y, mientras tanto, también como homocigoto para CYP3A5*3, mostró un nivel plasmático inesperadamente alto de tacrolimus como resultado de una eliminación extremadamente disminuida de tacrolimus (Werk et al., 2014).,
Similar a CYP3A4 * 26, CYP3A4 * 30 tiene un cambio de arginina a un codón de parada prematuro en la posición 130 (Hu et al., 2017). El Arg130 se considera importante para la incorporación del hemo (Eiselt et al., 2001) y, por lo tanto, la mutación de Arg130 interrumpiría la incorporación del hemo y afectaría la expresión de la holoenzima del CYP3A4.
en combinación con estudios previos (Tabla 3), algunas variantes alélicas del CYP3A4 mostraron las diferentes preferencias por los sustratos a diferencia de las enzimas de tipo silvestre. Es decir, algunas variantes exhiben actividades catalíticas alteradas con un perfil dependiente del sustrato., Como se mencionó anteriormente, los resultados contradictorios derivados de un sustrato específico en los estudios pueden surgir de muchos factores, como las discrepancias del método in vitro o in vivo y los diferentes sistemas de expresión heteróloga.
la quinina tiene efectos adversos frecuentes, debido a su estrecho índice terapéutico (Bateman y Dyson, 1986). Estas reacciones adversas no solo fueron inducidas por medicamentos; también fueron causadas por bebidas comunes que contienen quinina., En base a una revisión sistemática de los datos clínicos de ciento catorce artículos, las reacciones adversas, que fueron resultado de bebidas que contienen quinina, representaron el 20% del total de reacciones adversas a la quinina (Liles et al., 2016). Sorprendentemente, incluso con una exposición mínima a las bebidas comunes, algunos individuos experimentaron reacciones adversas graves que involucraron múltiples sistemas de órganos. Dada la evidente diversidad interindividual en la sensibilidad a la quinina, la variación del CYP3A4 puede ser uno de los posibles mecanismos subyacentes a los efectos adversos y sensibles a la quinina., Además, no se han establecido regulaciones para el uso de quinina en algunos países, como las píldoras que contienen 50 mg o menos de quinina se consideran un producto natural para la salud y están disponibles sin receta médica en Canadá (Liles et al., 2016); las lociones y champús que contienen quinina, así como las bebidas que contienen quinina, permanecen comúnmente disponibles y no se requiere supervisión. Por lo tanto, se cree que es necesario aumentar la conciencia de las diferencias interindividuales en la sensibilidad a la quinina y las reacciones adversas a la quinina entre los médicos y el público en general.