PMC (Magyar)
Vita
fontos, hogy a génváltozásokat a klinikai fenotípusokhoz kapcsoljuk a CYP3A4 aktivitás megfelelő fenotípusozó eszközeivel. A kinin 3-hidroxilációját a CYP3A4 aktivitás biomarker reakciójaként bizonyították, mivel a kinin 3-hidroxilációját a CYP3A4 katalizálja mind in vivo, mind in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Ezért a kinin-3-hidroxiláció enzimatikus katalízisének kinetikai paramétereit a CYP3A4 aktivitás mérésére használták a jelen vizsgálatban.
a rekombináns CYP3A4 holoenzimek közül huszonhárom szignifikánsan csökkentette a Klinint a kinin irányába. Hat változat, a CYP3A4*8 (R130Q), a CYP3A4*12 (L373F), a CYP3A4*13 (P416L), a CYP3A4*17 (F189S), a CYP3A4*20 (488 frameshift) és a CYP3A4*21 (Y319C), a kinin esetében sokkal alacsonyabb Klint (1,44–5,80%, 2.táblázat), mint a vad típusú CYP3A4*1A., Ha in vitro eredményeinket klinikai vizsgálatok során megismételjük, az allél hordozói potenciálisan CYP3A4-metabolizálók lehetnek, és i.a terápiás plazmakoncentrációk eléréséhez alacsonyabb kinin dózisokra van szükség; és ii. a hagyományos kinin adagok alkalmazása esetén fokozott a káros hatások és a toxicitás kockázata.
CYP3A4 * 2 (S222P) a kinin esetében a vad típusú CYP3A4*1A-hoz képest több mint hatszorosára csökkent a Klint (14, 76%, 2.táblázat)., Ez a csökkent enzimaktivitás azért lehet, mert egy szerin→prolin aminosav szubsztitúció jelentős változást okozhat az enzim háromdimenziós szerkezetében (a prolinról ismert, hogy megtöri az alfa-helixeket). Hasonlóképpen, a CYP3A4 * 2-ről beszámoltak arról, hogy a midazolám (Miyazaki et al., 2008), nifedipin (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018) és lidokain (Fang et al., 2017), mint a vad típusú enzim. Ezzel szemben a CYP3A4 * 2 magasabb Klintot mutatott az amiodaron számára (Yang et al., 2019)., A tesztoszteron esetében a CYP3A4*2 in vitro Escherichia coli express rendszerrel (Miyazaki et al., 2008), de az aktivitás összehasonlítható volt a vad típusú enzimmel, amikor baculovírus expressziós rendszerben (Sata et al., 2000) (3. táblázat).
CYP3A4 * 3 (M445T) alacsonyabb enzimaktivitást mutatott a kinin felé, mint a vad típusú allél (2.táblázat)., A 445 aminosav-maradék a megőrzött hem-kötő régióban található, mindössze két aminosav C-terminál az abszolút konzervált Cys-hez a 442 pozícióban a CYP3A4 proteinben (Sata et al., 2000); ezért a Met445Thr változás kedvezőtlen hatást gyakorolhat a hem kötésére, ami az enzim katalitikus aktivitásának megváltozását eredményezi, különösen megfelelő szubsztrát kötésekor. A 3.táblázatban említettek szerint azonban a CYP3A4*3 enzimaktivitása hasonló volt a legtöbb vizsgált szubsztrát esetében a vad típusú CYP3A4 enzimaktivitásához., Az eredmények eltérése az alkalmazott különböző heterológ expressziós módszerekből, valamint a variáns eltérő szubsztrátspecifikusságából eredhet.
CYP3A4*4 (I118V)mutatott alacsonyabb Klint felé kinin, képest vad típusú CYP3A4 * 1A. tanulmányok a helyszínen irányított mutagenesis arra utalnak, hogy a ser119 egy kulcsfontosságú aminosav, bevonva egy aktív hely maradékot (Yano et al., 2004). Ezért az Ile118Val mutáció valószínűleg befolyásolja az aktív hely konformációját, ami csökkent katalitikus aktivitást eredményez., Hasonlóképpen, egy in vivo vizsgálat kimutatta, hogy a 6β-hidroxikortizol/szabad kortizol vizeletszintjének aránya ezekben a heterozigóta egyénekben alacsonyabb volt, mint az egészséges kontrollokban, ami csökkent enzimatikus aktivitásra utal (Hsieh et al., 2001).
mind a CYP3A4*8, mind a *13 változat kimutatható, bár alacsonyabb CYP3A4-holoproteinek szintjét mutatta, és rendkívül alacsony katalitikus aktivitással rendelkezett a kininnel szemben. Eredményeinkkel ellentétben a CYP3A4*8 és *13 baktériumrendszerekben (Eiselt et al., 2001)., Úgy gondoljuk, hogy a használata bakteriális vs.rovar expressziós rendszerek magyarázhatják a különböző eredményeket. A bakteriális expressziós rendszerből hiányzik egy intracelluláris membránkörnyezet (Gonzalez and Korzekwa, 1995), amely a fehérje nagy expressziójához szükséges. Ezzel szemben a rovarsejtek az emberi sejtekhez hasonló módon képesek feldolgozni és módosítani a fehérjéket, lehetővé téve az enzim megfelelő lehajtását és a hem-kofaktor beépülését, ami a CYP3A4 fehérjék nagyobb expresszióját eredményezi.,
a CYP3A4*11-et (T363M) szignifikánsan alacsonyabb szinten fejezték ki, mint a vad típusú CYP3A4-et (2.ábra), ami összhangban van a bakteriális vagy emlős expressziós rendszerekkel végzett vizsgálatokkal (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Treonin a maradék 363 belül a szubsztrát elismerés helyszínen (SRS)-5 hozzájárulhat a hidrogén kötés hálózat kialakulását. A treonin-metionin helyettesítés a katalitikus aktivitás elvesztését eredményezheti (Murayama et al., 2002). Tehát a CYP3A4*11 csökkent kinin-hidroxilációs aktivitást mutatott a jelenlegi vizsgálatban., Ezenkívül a CYP3A4*11 csökkent tesztoszteron-hidroxilációs aktivitást mutatott (Murayama et al., 2002), feltűnően megnövekedett CLint felé lidokain (Fang et al., 2017) és amiodaron (Yang et al., 2019), de nem társult az ibrutinib metabolikus aktivitásának észrevehető változásaival (Xu et al., 2018) (3. táblázat).
CYP3A4 * 12 (L373F) drámaian csökkent Klint a kinin felé, hasonlóan a midazolam (Eiselt et al., 2001)., A CYP3A4 * 12 rendelkezik a Leu373Phe aminosav-változásával; a mutált maradék az Arg-372 és a Glu-374 közelében található, amelyek részt vesznek egy hidrogénkötő hálózat kialakításában, és aktív helyeken vesznek részt a hely által irányított mutagenezist (Yano et al., 2004). Ezért a mutációs maradék (l373f) valószínűleg befolyásolja a hidrogénkötő hálózat stabilitását és az aktív hely üregének térbeli konformációját, ami a CYP3A4*12 katalitikus aktivitásának megváltozását eredményezi.,
CYP3A4 * 20 (488 frameshift) szignifikánsan csökkent apoprotein expressziót mutatott (1.ábra), és drámaian csökkentette a Klint-et a kinin felé. Ezzel szemben a midazolám 1′- és 4-hidroxiláció katalitikus aktivitásáról nem számoltak be az élesztőben vagy a CYP3A4*20-at expresszáló 293 HEK mikroszómában (Westlind-Johnsson et al., 2006). Ezek az egymásnak ellentmondó eredmények a kísérletekben használt különböző heterológ expressziós rendszereknek és szubsztrátumoknak tulajdoníthatók. Ezenkívül a brazil egyénekben azonosított CYP3A4*20 heterozigótról számoltak be, hogy ∼1-es szisztémás clearance-e csökkent.,9-szeres midazolám in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Korábban feltételezték, hogy ez a ritka mutáció befolyásolhatja a fehérje hajtogatását, heme beépülését (Westlind-Johnsson et al., 2006), valamint az aktív hely üregének térbeli konformációja, ami az alkalmazott szubsztrátumhoz kapcsolódó katalitikus aktivitás csökkenését vagy elvesztését eredményezi.
CYP3A4*21 (Y319C), amelyet Kínai populációban azonosítottak (Zhou et al., 2011), tanulmányunkban gyenge katalitikus aktivitást mutatott a kinin felé. Érdekes módon eredményeinkben Nem találtunk kimutatható apoenzim kifejezést., A Tyr319 egy erősen konzervált maradék a citokróm P450 családban az eukarióta evolúcióban a fonálféregtől az emberig (Zhou et al., 2011). Szerint in silico funkcionális előrejelzések (Zhou et al., 2011), A Tyr319-szermaradék fontos területen fekszik, és a Tyr CYS-vel való helyettesítése a CYP3A4*21 fehérje 319-es pozíciójában drámai változásokat idézhet elő az aktív hely üregkonfigurációjában. Ezért a CYP3A4 * 21 hibás fehérjét termelhet, amelynek katalitikus aktivitása csökken a kinin felé., Továbbá arra gondoltunk, hogy ezek az antitestek, amelyeket a CYP3A4 rekombináns apoproteinek kimutatására használtunk, nem alkalmasak a CYP3A4*21 variáns kimutatására. Vagyis a TYR319CYS mutációja a CYP3A4*21-ben megakadályozhatja, hogy ezek az antitestek felismerjék a CYP3A4 specifikus epitópjait.
ezzel szemben a rekombináns CYP3A4 holoenzimek közül kettő, a CYP3A4*15 (R162Q) és a CYP3A4*29 (F113I) szignifikánsan emelkedett Kininszintet mutatott. Hasonlóképpen, mind a CYP3A4*15, mind a CYP3A4*29 fokozott Klint mutatott a lidokain felé (Fang et al., 2017), de azt mutatta, csökkent CLint for ibrutinib (Xu et al., 2018)., A CYP3A4*15-öt először különböző etnikai populációkban észlelték, kis mintákkal minden etnikai csoporthoz (Lamba et al., 2002). A CYP3A4*29-et a közelmúltban végzett tanulmányunkban (Hu et al., 2017). A két változat a kinin in vitro gyors metabolizmusához kapcsolódik. Ha a kinin clearance emelkedésének megerősítése olyan személyeknél fordul elő, akik a CYP3A4*29 vagy a CYP3A4*15 homozigóta vagy heterozigóta hordozói, ezek az egyének lehetnek a kinin CYP3A4 ultra-gyors metabolizálói., Az ilyen genotípusú betegek: i) rosszabb terápiás hatásúak lehetnek a szokásos klinikai kinin adagok alkalmazása esetén; és ii) nagyobb dózisokra van szükség a terápiás plazmakoncentrációk eléréséhez.
a CYP3A4*6 (277 frameshift), a CYP3A4*26 (R268Stop) és a CYP3A4*30 (R130Stop) variánsok aktív holoenzimjeit nem észlelték, és ennek megfelelően nem mutattak metabolikus aktivitást a kininre (2.táblázat).,
a CYP3A4*6 van egy beillesztése egy adenin maradékot exonban 9 (830-831 insA); ez a mutáció okoz az olvasási vezet a fordítás egy csonkolt fehérje, amely nem foglalja bele hem (Hsieh et al., 2001). Következésképpen a CYP3A4*6 kininnel szembeni katalitikus aktivitását nem azonosítottuk vizsgálatunkban. Amint azt korábban in vivo is kimutatták, egy kínai személy heterozigóta volt a CYP3A4*6 esetében, a vizelet 6β-hidroxikortizolszintjének sokkal alacsonyabb arányával:szabad kortizol, mint a vad típusú egyének, ami arra utal, hogy csökkent a CYP3A4 aktivitás (Hsieh et al., 2001)., Hasonlóképpen, egy szervátültetésen átesett, a CYP3A4*6-ra heterozigóta beteg esetében a takrolimusz-koncentráció / dózis aránya 4,3-szor magasabb volt, mint a vad típusú betegeknél (Jun et al., 2009).
a CYP3A4*26-nak C→t nukleotid szubsztitúciója van az exon 5-ben. Ez okozza a változás az arginin egy korai stop kodon a helyzetben, 268, – az eredmény pedig egy feltételezett rövidebb fehérje hiányzik katalitikus domain, ezért tevékenység (Werk et al., 2014)., A CYP3A4*26 nem fejezhető ki a korai stop kodon miatt a 268-as pozícióban, vagy ha igen, akkor a fehérjét a gyors lebomlásra lehet jelölni (Werk et al., 2014). Ennek megfelelően nem tudtuk kimutatni az SF21 sejtekben kifejezett CYP3A4*26 variáns holoproteinjét. Hasonlóképpen, egy 19 éves veseátültetett beteg, akit homozigótaként azonosítottak a CYP3A4*26-ra, és eközben a CYP3A5*3 homozigótája is, váratlanul magas takrolimusz plazmaszintet mutatott a rendkívül csökkent takrolimusz clearance (Werk et al., 2014).,
a CYP3A4*26-hoz hasonlóan a CYP3A4*30 argininről idő előtti stop kodonra vált a 130-as pozícióban (Hu et al., 2017). Az Arg130 a heme beépítése szempontjából fontos (Eiselt et al., 2001), és így az Arg130 mutációja megzavarná a heminjekciót, és így befolyásolná a CYP3A4 holoenzim expresszióját.
a korábbi vizsgálatokkal (3.táblázat) kombinálva néhány CYP3A4 allélos változat a szubsztrátokra vonatkozó eltérő preferenciákat mutatta, ellentétben a vad típusú enzimekkel. Nevezetesen, egyes változatok módosított katalitikus tevékenységeket mutatnak szubsztrátfüggő profillal., Amint a fentiekben tárgyaltuk, a vizsgálatok során egy adott szubsztrátból származó ellentmondásos eredmények számos tényezőből származhatnak, mint például az in vitro vagy in vivo módszertől való eltérések, valamint a különböző heterológ expressziós rendszerek.
A Kininnek gyakori káros hatása van, szűk terápiás indexe miatt (Bateman and Dyson, 1986). Ezeket a mellékhatásokat nem csak gyógyszerek indukálták, hanem gyakori kinintartalmú italok is okozták., A 144 cikkből származó klinikai adatok szisztematikus felülvizsgálata alapján a kinint tartalmazó italokból származó mellékhatások a kininre gyakorolt összes mellékhatás 20% – át tették ki (Liles et al., 2016). Meglepő módon, még a közönséges italok percenkénti expozíciója esetén is, néhány személy súlyos mellékhatásokat tapasztalt, amelyek több szervrendszert érintettek. Tekintettel a kinin érzékenységének nyilvánvaló egyéni sokféleségére, a CYP3A4 variációja lehet A kininérzékeny és káros hatások alapjául szolgáló egyik lehetséges mechanizmus., Ezenkívül egyes országokban nem állapították meg a kinin használatára vonatkozó szabályokat, például az 50 mg vagy annál kevesebb kinint tartalmazó tablettákat természetes egészségügyi terméknek tekintik, és Kanadában recept nélkül kaphatók (Liles et al., 2016); a kinintartalmú krémek és samponok, valamint a kinintartalmú italok továbbra is általánosan elérhetők, felügyeletre nincs szükség. Ezért szükségesnek tartják az orvosok és a lakosság körében a kinin érzékenységének és a kininre gyakorolt mellékhatásoknak az egyének közötti különbségeivel kapcsolatos fokozott tudatosságot.